高效液相色谱法波长切换法同时测定吴茱萸中3组分含量

申丽莎，陈国庆，杨 帆，邓开英

（1．重庆市中药研究院，重庆 400061； 2．重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121； 3．重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 401121）

高效液相色谱法波长切换法同时测定吴茱萸中3组分含量

申丽莎1，陈国庆1，杨 帆2，3，邓开英2，3

（1．重庆市中药研究院，重庆 400061； 2．重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121； 3．重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 401121）

目的建立同时测定吴茱萸中吴茱萸内酯、吴茱碱和吴茱萸次碱含量的高效液相色谱（HPLC）波长切换法。方法色谱柱为C18柱（250 mm×4．6 mm，5 m），流动相为乙腈-0．2%磷酸溶液（35∶65），流速为2．0 mL／min，柱温为30℃，波长切换（0～15 min，205 nm；15．01～28 min，225 nm）。结果吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱进样量分别在0．186～3．72 g，0．040 24～0．804 8 g，0．040 08～0．801 6 g范围内与峰面积线性关系良好(r=0．999 7，0．999 9，0．999 9)，平均回收率分别为96．30%，97．66%，97．46%，RSD分别为1．43%，1．32%，1．80%（n=6）。结论该法简便，快速准确，灵敏度高，重复性好，可用于吴茱萸药材的质量控制。

吴茱萸；吴茱萸内酯；吴茱萸碱；吴茱萸次碱；高效液相色谱法；含量测定

吴茱萸为常用中药，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻之功效，主治厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸、五更泄泻，外治口疮、高血压[1-3]。吴茱萸药材中的吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱是其主要的3个活性成分[4]，故建立高灵敏度、干扰少、精密度高及处理简单的测定3种成分的检测方法十分必要。2010年版《中国药典（一部）》[5]和文献[6-9]中，分别采用乙腈-水-四氢呋喃-冰醋酸和乙腈-庚烷磺酸钠溶液等为流动相、225 nm波长检测吴茱萸药材中3组分的含量。还有研究报道，采用甲醇-水为流动相，梯度洗脱后225 nm波长同时检测3组分的含量[10]。此类方法虽能同时测定 3组分，但其流动相组成较复杂或含缓冲盐，对色谱柱和仪器系统不利，且吴茱萸内酯在225 nm波长处响应低，灵敏度不够。故本试验中建立了以乙腈-0．2%磷酸为流动相，以205 nm波长检测吴茱萸内酯、225 nm波长检测吴茱萸碱和吴茱萸次碱的高效液相色谱(HPLC)法，色谱峰分离良好，基线平稳，各成分响应灵敏，可为吴茱萸的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国），HP-Chmestation色谱工作站；BP211S型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；Simplicity-185型超纯水机（美国Millipore公司）；KQ500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。吴茱萸内酯对照品（批号为110800-200203）、吴茱萸碱对照品（批号为110802-200504）和吴茱萸次碱对照品（批号为110801-200505）均购自中国食品药品检定研究院；吴茱萸饮片（重庆慈晟药业有限公司、重庆市中药饮片厂有限公司和重庆鑫斛药房连锁有限公司各1批），经重庆市食品药品检验检测研究院杨帆副主任药师鉴定，均为芸香科植物吴茱萸 Evodia rutaecarpa（Juss．）Benth．的干燥果实；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Zobax SB C18柱（250 mm4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0．2%磷酸溶液（35∶65）；流速：2．0 mL／min；柱温：30℃；检测波长切换：0～15 min时205 nm，15．01～28 min时225 nm；进样量：10 μL。在此色谱条件下，样品色谱峰分离良好，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2．2 溶液制备

称取吴茱萸内酯对照品23．25 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中；精密称取吴茱萸碱10．06 mg、吴茱萸次碱10．02 mg，精密称定，分置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；分别精密量取上述3种对照品溶液各1 mL，置同一5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。取吴茱萸样品，粉碎，过3号筛，取粉末0．5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，密塞，称定质量，浸泡1 h，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用80%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2．3 方法学考察

线性关系考察：取2．2项下对照品溶液，分别进样1，5，10，15，20 μL，测定峰面积。以进样量（C,μg）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，得回归方程：A=319．61 C-23．644，r= 0．999 6；A=4 704．6 C-17．892，r=0．999 9；A=2 551．9 C-10．306，r=0．999 9。结果表明，吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱进样量分别为0．186～3．72 μg、0．040 24～0．804 8 μg、0．040 08～0．801 6 μg时与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液 10 μL，连续进样 5次。结果，吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱峰面积的 RSD分别为1．1%，0．9%，1．3%（n=5），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批样品，依法制备供试品溶液各5份，测定含量。结果，吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量的 RSD分别为1．5%，1．6%，2．0%（n=5），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取新制备的同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12 h时进样10 μL。结果，吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱峰面积的 RSD分别为1．0%，0．3%，1．1%（n=5），表明供试品溶液在12 h内稳定。

加样回收试验：精密称取已知含量的同批样品0．25 g 6份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照品溶液适量，按2．2项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率。结果见表1。

表1 3组分加样回收试验结果（n=6）

2．4 样品含量测定

按拟订方法测定3批吴茱萸样品的含量。结果3批样品吴茱萸内酯含量分别为20．6，10．2，5．4 mg／g；吴茱萸碱含量分别为 19．8，2．1，15．7 mg／g；吴茱萸次碱的含量分别为13．1，1．8，8．7 mg／g。

3 讨论

本试验中采用2010年版《中国药典（一部）》吴茱萸药材项下含量测定方法，以80%乙醇作为提取溶剂，经浸泡后再超声提取，基本能将样品中的待测成分提取完全。

本试验中简化了流动相，在保证各成分分离效果的基础上，可减少对仪器和色谱柱的损伤。流动相考察中，比较了乙腈-水、乙腈-0．1%磷酸、乙腈-0．2%磷酸不同溶剂系统，结果表明以乙腈-0．2%磷酸为流动相，各峰分离度好。

分别采用205 nm检测吴茱萸内酯、225 nm检测吴茱萸碱和吴茱萸次碱，可使3组分分别达到较好的响应值，灵敏度更高。经DAD检测，样品中3组分色谱峰与对应的对照品紫外光谱一致。

[1]戴媛媛，刘保林，窦昌贵．吴茱萸及其有效成分的药理研究进展[J]．中药材，2003，26（4）：295．

[2]龚慕辛，王智民，张启伟，等．吴茱萸有效成分的药理研究进展[J]．中药新药与临床药理，2009，20（2）：183．

[3]杨云云，郭 惠，王昌利．吴茱萸生物碱及其主要成分吴茱萸次碱药理研究进展[J]．中药药理与临床，2010，26（5）：182．

[4]姚 迪，孙晶晶，刘 雷，等．LC-MS／MS法测定大鼠血浆中的吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸内酯及其生物利用度的研究[J]．华西药学杂志，2014，29（3）：298．

[5]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：282．

[6]何咏梅，田 静，邓 晶．HPLC法同时测定吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱与吴茱萸内酯的含量[J]．中国药房，2012，23（31）：2 944．

[7]宋亚芳，王智民，朱晶晶，等．一测多评法测定吴茱萸中吴茱萸内酯、吴茱萸碱及吴茱萸次碱的含量[J]．中国中药杂志，2009，34（21）：2 781．

[8]鲍天冬，董 宇，杨 庆，等．高效液相色谱法同时测定制吴茱萸及其提取物中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸内酯含量[J]．中国实验方剂学杂志，2007，13（6）：1．

[9]吴建平，谭桂山，徐康平，等．高效液相色谱法测定吴茱萸提取物中吴茱萸碱、吴茱萸次碱及吴茱萸内酯的含量[J]．湖南中医药导报，2002，8（5）：227．

[10]苏娟娟，张 璐，何明珍，等．HPLC同时测定吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸内酯的含量[J]．江西中医学院学报，2009，21（6）：53．

SimultaneousDeterminationof3Componentsin EuodiaeFructusbyHPLC Wavelength Switching Technology

Shen Lisha1，Chen Guoqing1，Yang Fan2,3,Deng Kaiying2,3
(1．Chongqing Academy of Chinese Materia Medica,Chongqing,China 400061; 2．Chongqing Institute for Food and Drug Control,Chongqing,China 401121； 3．Chongqing Engineering Center for Pharmaceutical Process and Quality Control，Chongqing,China 401121)

Objective To develop an HPLC method for simultaneous determination of 3 components in Euodiae Fructus．M ethods A C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm)was used with the mobile phase of acetonitrile-0．2% phosphoric acid(35∶65)with the flow rate of 2．0 mL／min and the column temperature was 30℃．The detection wavelength was set at 205 nm for Evodine in the first 15．01 min, and then changed to 225 nm for evodiamine and rutaecarpine between 15．01 and 28 min．Results The linear ranges of evodine,evodiamine and rutaecarpine fell within the ranges of 0．186～3．72 μg,0．040 24～0．804 8 μg,0．040 08～0．801 6 μg,respectively (r=0．999 7，0．999 9，0．999 9)．The average recoveries were 96．30%,97．66% and 97．46% with RSD were 1．43%,1．32% and 1．80%,respectively（n=6）．Conclusion The method is convenient，quick，accurate and suitable for the qulity control of Euodiae Fructus．

Euodiae Fructus;Evodine;Evodiamine;Rutaecarpine;HPLC;wavelength switching;determination

R284.1；R282.71

A

1006-4931(2015)21-0115-03

申丽莎，女，药师，主要从事中药生产与质量检测工作，（电子信箱）shenlisa＠163．com；邓开英，女，主任药师，研究方向为药品质量控制，本文通讯作者，（电子信箱）dengkaiying6811＠sina．com。

2015-07-23；

2015-10-27)

重庆市科委自然科学基金计划资助项目，项目编号：cstc2012jjA10154。