促甲状腺激素受体可在微血管内皮细胞表达*

杨光燃 杨芳远 曹 曦 杨金奎

促甲状腺激素受体可在微血管内皮细胞表达*

杨光燃 杨芳远 曹 曦 杨金奎

目的：检测促甲状腺激素受体(TSHR)在小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)的表达。方法：取对数生长期bEnd.3细胞，采用RT-PCR和Western Boltting方法检测bEnd.3细胞TSHR mRNA和蛋白表达水平。结果：bEnd.3 细胞总RNA浓度为2.9186μg/μl，A260/A280为1.97。TSHR mRNA的扩增效率为96.41%±0.82%，溶解曲线呈单峰，相对表达量为0.64±0.14(相对睾丸组织)。电泳结果显示bEnd.3 细胞能清晰表达TSHR mRNA。Western Blotting显示bEnd.3细胞可以检测到TSHR的α和β亚基蛋白表达，β亚基相对表达量为0.46±0.05(相对β-actin)。结论：小鼠脑微血管内皮细胞可表达TSHR，该结果有助于临床研究TSH对血管内皮细胞功能的影响。

促甲状腺激素受体； 微血管； 内皮细胞

促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hormone, TSH)是由垂体促甲状腺细胞合成的一种异三聚体糖蛋白，主要靶器官为甲状腺，通过与甲状腺细胞表面TSH受体 (Thyroid Stimulating Hormone Receptor, TSHR) 结合来调节甲状腺细胞的生长、增殖和分化。有研究者通过RT-PCR等技术证实，TSHR除了存在于甲状腺滤泡细胞膜外，尚存在于多种甲状腺外组织细胞，如大脑组织、眼外肌、肾脏、睾丸等[1-5]。但是脑微血管内皮细胞上是否有TSHR表达鲜有研究报道。本文检测小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)TSHR mRNA和蛋白表达水平，为TSH与脑微血管关系的机制研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂与仪器

bEnd.3细胞购自美国ATCC公司。睾丸组织取自成年C56BL/6小鼠(n=3)。DMEM培养基(批号11995-065)、超纯RNA提取试剂盒(批号CW0581)、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(批号CW0744)、SYBR PCR 预混体系(批号 CW0956)、DNase 1(批号CW2090)、BCA蛋白定量试剂盒(批号02912E)均为美国CWbio公司产品；蛋白酶抑制剂(批号04693116001，美国Roche公司)；TSHR抗体(批号SC-13936，美国Santa Cruz公司)；β-actin(批号TA-09，中杉金桥公司)；RIPA蛋白抽提试剂(批号R00010，北京索莱宝公司)。PCR仪(Linegen型，杭州博日公司)；电泳仪(HT-Sub02型，北京鸿涛基业)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养bEnd.3细胞至对数生长期，接种于10ml培养瓶中(n=3)，置于37℃、5% CO2细胞恒温孵育箱内培养，待细胞覆盖瓶底约80%后吸出培养液，用1M PBS漂洗1次，0.05%胰酶-EDTA消化液消化细胞，离心后再用1M PBS漂洗1次。所得细胞用于TSH mRNA和蛋白水平的检测。

1.2.2 PCR引物设计： TSHR和内参GAPDH基因引物根据标准RT-PCR引物原则设计，TSHR引物序列参照文献[6]，由Invitrogen公司合成。见表1。

表1 TSHR引物和内参引物

1.2.3 RT-PCR检测TSH mRNA相对表达量：按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA。bEnd.3 细胞总RNA浓度为2.9186μg/μl，A260/A280为1.97，纯度较高。按照HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒说明书，反应体系为：引物 2μl、RNA 模板 2μl、加RNase-Free water至15μl，65℃孵育5min，迅速冰浴，短暂离心(12 000rpm,4℃)。继续向以上反应液中加入以下试剂：5×RT混合液 4μl、HiFi-MMLV酶混合液 1μl，混匀，37℃孵育40min。反应结束后70℃保温10min。SYBR PCR扩增，按说明书进行，反应体系为：SYBR PCR 预混体系(2×) 10μl，上、下游引物(10μM)各1μl，模板 2μl，加入灭菌蒸馏水至20μl。扩增程序为：95℃ 10min， 95℃ 15s后，59℃ 60s，45个循环。每个样本设2个复孔，采用2-△△ct方法计算bEnd.3 细胞和睾丸组织的mRNA表达量，再将睾丸组织的TSHR mRNA表达量设定为1，计算bEnd.3 细胞的TSHR mRNA相对表达量。

1.2.4 Western Blotting检测TSHR蛋白表达：待测样本中加入预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂进行蛋白抽提，取上清，用BCA法定量测定蛋白浓度。配制10%分离胶，浓缩胶浓度为5%。待测蛋白样品上样量30μg/孔。电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压120V，约90min。湿转法300mA恒流转膜100min。封闭：将膜完全浸没于5%BSA-TBST中，水平摇床孵育1h(RT)。一抗孵育4℃过夜，次日TBST洗膜3次，每次10min。二抗孵育，山羊抗兔IgG(H+L)HRP和山羊抗鼠IgG(H+L)HRP 1∶10 000，室温孵育 40min。TBST洗膜3次，每次10min。ECL滴加到膜的蛋白面，反应3-5min；胶片曝光显影。每个样本设2个复孔，以目标蛋白与β-actin电泳条带的灰度比值作为该蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 bEnd.3细胞TSHR mRNA表达量

TSHR mRNA的扩增效率(96.41%±0.82%)较高，溶解曲线呈单峰，特异性强，见图1。定量分析结果表明bEnd.3细胞TSHR mRNA相对表达量为0.64±0.14。电泳结果显示，bEnd.3 细胞能清晰表达TSHR mRNA(图2)。

2.2 bEnd.3细胞TSHR 蛋白表达量

bEnd.3细胞经Western Blotting电泳可以检测到抗体说明书上标示的TSHR的β亚基(42kd)和 α亚基(62kd)，而睾丸组织只检测到β亚基(图3)。电泳条带灰度分析显示bEnd.3 细胞TSHR β亚基蛋白相对表达量为0.46±0.05，低于睾丸组织TSHR β亚基蛋白的相对表达量(0.72±0.06)。

图1 TSHR mRNA扩增(上图)、溶解(下图)曲线

图2 bEnd.3细胞TSHR mRNA电泳图

图3 bEnd.3 细胞TSHR蛋白电泳图

3 讨 论

以往研究认为TSHR主要表达于甲状腺、眼外肌、大脑的某些特定部位[1-3]、肾脏以及睾丸[4-6]。本研究发现TSHR可表达于小鼠脑部微血管内皮细胞。

TSHR在多种组织细胞的表达，可能与其对不同组织细胞的作用有关。近年研究发现亚临床甲状腺功能减退症(Subclinical Hypothyroidism, SCH)患者的血清TSH水平升高而甲状腺激素正常这种状态，与血管功能受损[7]、心功能障碍[8]等有关，因此认为，SCH与高血压、高脂血症、高血糖等一样，是缺血性心脏病的独立危险因素[9]，而且可能增加冠心病事件及冠心病死亡风险[10]。另有研究报道，甲状腺功能正常人群，其TSH水平升高与冠心病患者颈动脉内膜中层厚度[11]、心力衰竭预后[12]、总胆固醇水平[13]、老年男性代谢综合征的患病风险[14]均有关。部分原因可能是TSH参与肝脏的胆固醇代谢[15]及甘油三酯代谢[16，17]。

关于微血管内皮细胞上是否有TSHR表达鲜有研究报道。已有的研究证实肝细胞和脐静脉内皮细胞上可检测到TSHR表达[16，18]。还有临床研究将127例合并SCH患者与随机选择的甲状腺功能正常2型糖尿病患者进行比较，结果发现前者有较高的糖尿病视网膜病变患病率，特别是威胁视力的视网膜病变[19]。另一项病例对照研究也证实，增殖型视网膜病变患者有较高的SCH患病率，并且在校正性别、年龄、糖化血红蛋白等因素后两者仍呈正相关，而且增殖型视网膜病变合并糖尿病肾病患者在进一步校正尿白蛋白排泄率和血肌酐后，增殖型视网膜病变仍与TSH升高有关[20]。

目前有关TSH水平升高增加微血管病变风险的机制尚不明确。本研究通过RT-PCR和Western Blotting发现小鼠脑微血管内皮细胞可表达TSHR mRNA和蛋白。该结果可能有助于进一步探讨TSH对微血管内皮细胞的影响及其作用机制。

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本文第一作者简介：

杨光燃(1972—)，女，汉族，博士，副主任医师，研究方向为糖尿病及其并发症

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Expression of Thyroid Stimulating Hormone Receptor on Microvascular Endothelial Cells

YANG Guang-ran, YANG Fang-yuan, CAO Xi, YANG Jin-kui

Department of Endocrinology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing 100730, China

Objective:To evaluate the expression of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) on mouse microvascular endothelial cells (bEnd.3). Method:Real-time PCR and Western-boltting were used to analyze the expression of TSHR mRNA and TSHR protein in the bEnd.3 cells.Results:TSHR mRNA expression was detected in the bEnd.3 cells. The content of RNA in the bEnd.3 cells was 2.9186μg/μl, and its ratio of A260/A280 was 1.97. TSHR was amplified and the amplification efficiency was 96.41%±0.82%. Dissociation curve from real-time PCR was unimodal. The relative quantity of TSHR mRNA in the bEnd.3 cells was 0.64±0.14, when the quantity of TSHR mRNA in the testicle was set as 1.0. TSHR α and β subunit were detected by Western-blotting. The protein ratio of TSHRβ/β-actin was 0.46±0.05 in the gray scale analysis.Conclusion:The expression of TSHR could be found in the bEnd.3 cells. This finding may be helpful to explore the effect of thyroid stimulating hormone on microvascular endothelial cells.

Thyroid stimulating hormone receptor； Microvascular； Endothelial cell

国家自然科学基金项目(81471009)；北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划(2014-3-013)；首都医科大学基础临床科研合作课题(14JL46)

首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科，北京 100730

本文2015-04-21收到，2015-06-24修回

R581

A

1005-1740(2015)03-0009-04