蛋白激酶C-β抑制剂LY333531对1型糖尿病大鼠肾功能的影响*

伍婷婷 曾 吉 张百芳 叶 凤

蛋白激酶C-β抑制剂LY333531对1型糖尿病大鼠肾功能的影响*

伍婷婷1曾 吉1张百芳2叶 凤2

目的：观察蛋白激酶C(PKC)-β抑制剂LY333531对1型糖尿病大鼠肾功能的保护作用。方法：27只SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组和LY组，每组各9只。后两组采用一次性尾静脉注射60mg/kg链脲佐菌素(STZ)成功构建1型糖尿病模型。LY组大鼠给予PKC-β抑制剂LY333531(10mg/kg/天)灌胃治疗8周。抽取各组大鼠颈动脉血并留取24h尿液，测量血糖、内生肌酐清除率和24h尿蛋白。之后处死各组大鼠，摘取肾脏称重并计算肾重/体重。统计学分析各组上述指标的差异。结果：与正常对照组比较，糖尿病组和LY组大鼠的体重均明显减轻，而肾重、肾重/体重、血糖及24h尿蛋白均显著升高(P<0.05)；LY组大鼠的肾重/体重、内生肌酐清除率及24h尿蛋白水平均低于糖尿病组(P<0.05)，两组肾重、体重和血糖差异无统计学意义(P>0.05)。结论：PKC-β抑制剂LY333531有利于改善1型糖尿病大鼠内生肌酐清除率和减少蛋白尿的产生。

糖尿病； 蛋白激酶C-β抑制剂LY333531； 肾功能； 大鼠

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病危害性最大的慢性并发症之一，其发病机制极为复杂。在1型和2型糖尿病患者中，高血糖是导致DN发生的一个重要原因。长期高血糖环境可诱导细胞内糖基化终末代谢产物增加，氧化应激、多元醇通路以及蛋白激酶C(Protein Kinase，PKC)信号途径激活。而这些病理途径又相互影响、逐级放大，最终发展至终末期肾病[1]。因此，抑制PKC活化可能是减少肾脏损害、防治DN发生的策略之一。本实验以链脲佐菌素(STZ)诱导SD大鼠1型糖尿病模型后，应用PKC-β抑制剂LY333531对模型大鼠进行灌胃治疗，观察其肾功能改变，为PKC-β抑制剂治疗DN提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和仪器

200-250g雄性SD大鼠(武汉大学实验动物中心提供，许可证号SCXK 2008-0004)。STZ(美国Sigma公司，货号S0130)，PKC-β抑制剂LY333531(美国礼来公司，货号A1401)，血糖检测试剂盒(德国西门子公司，批号07193)，肌酐检测试剂盒(武汉长新盛生物技术有限公司，批号071504017)，尿蛋白测定试剂盒(德国西门子公司，批号19018)，其它试剂均为国产或进口分析纯。自动生化分析仪(德国西门子公司，型号Advial 2400)。

1.2 1型糖尿病大鼠模型的构建和分组

27只SD大鼠常规饲养一周后，采用随机抽签法分为三组：正常对照组、糖尿病组和LY组，每组各9只。糖尿病组和LY组采用一次性尾静脉注射60mg/kg STZ(以0.1mol/L、pH 4.5的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为溶剂)构建1型糖尿病模型，对照组注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72h后测其血糖浓度>16.7mmol/L，为1型糖尿病造模成功[2]。糖尿病组和LY组18只大鼠均造模成功。成模后，LY组灌胃给予PKC-β抑制剂LY333531(10mg/kg，以0.9%氯化钠注射液为溶剂，1次/天)，连续8周。正常对照组和糖尿病组灌胃等量生理盐水。每天测定血糖、体重，记录大鼠的饮食和饮水量。

1.3 观察指标和方法

1.3.1 24h尿肌酐和尿蛋白：三组大鼠均在处死前两天进入代谢笼，收集24h尿液，准确记录24h尿量，充分混匀后取5ml保存于-20℃冰箱，检测24h尿蛋白和尿肌酐含量。

1.3.2 血糖、血肌酐和内生肌酐清除率：实验结束前大鼠禁食12h，经戊巴比妥钠麻醉后颈动脉取血，离心，收集血清保存于-20℃冰箱中，检测血糖和血肌酐含量，并计算内生肌酐清除率(ml/min)[=尿肌酐×每分钟尿量/血肌酐]。

1.3.3 肾重/体重：实验结束后处死大鼠，迅速取出肾脏，去除包膜，生理盐水冲洗干净后吸干表面水分，无菌称重，计算肾重/体重。

1.4 统计学处理

2 结 果

实验结束时各组大鼠各指标差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组比较，糖尿病组和LY组大鼠体重减轻(t=-28.957、-28.671，P<0.05)，肾脏重量增加(t=4.293、3.060，P<0.05)，肾重/体重升高(t=5.870、5.513，P<0.05)，血糖水平升高(t=24.284、14.325，P<0.05)，24h尿蛋白增加(t=12.964、9.702，P<0.05)。糖尿病组大鼠的内生肌酐清除率高于正常对照组(t=3.717，P<0.05)。而LY组大鼠肾重/体重、内生肌酐清除率和24h尿蛋白水平低于糖尿病组(t=-2.421、-2.684、-3.730，P<0.05)，且内生肌酐清除率水平与正常对照组差异无统计学意义(t=1.184，P>0.05)。糖尿病组与LY组肾重、体重和血糖水平差异无统计学意义(t=1.226、1.657、0.065，P>0.05)。见表1。

3 讨 论

近年来随着糖尿病发病率逐年上升，DN已成为世界范围内引起终末期肾病的首要原因[3]，其主要病理特征表现为肾小球滤过功能降低、肾小球足细胞损伤、大量蛋白尿、系膜基质增多、进行性肾小球纤维化等[4]。但DN的发病机制仍不十分清楚，糖代谢紊乱、血流动力学异常、细胞因子过表达都可能参与DN的发生和发展[5]。目前临床治疗DN的主要方法是控制血糖和血压，但其疗效存在一定的局限性。因此，寻找更有效的防治DN的方法十分必要。

表1 8周后各组大鼠相关指标水平

注：与正常对照组比较，1)P<0.05；与糖尿病组比较，2)P<0.05

有研究发现糖代谢异常和血流动力学变化均可促进肾脏PKC的表达，参与DN的病理过程[1]。高血糖诱导的氧化应激与糖尿病及其并发症密切相关，而氧化应激引起尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Dinucleotide Phosphate，NADPH)氧化酶大量激活，诱导产生过量活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的过程依赖于PKC的活化[6]。现已发现PKC大约有12种结构和底物不同的异构体，其中研究最多的是传统型PKC 亚基(PKC-α和PKC-β)。活化的PKC-β可通过各种信号转导途径上调肾脏多种细胞因子的表达，包括血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、转化生长因子-β1(Tansforming Growth Factor-β1，TGF-β1)等[7,8]。已有研究表明TGF-β1和VEGF是参与肾小球细胞外基质大量积聚、肾小球纤维化以及蛋白尿形成过程中重要的细胞因子[9]。Ohshiro等[10]研究发现敲除实验小鼠PKC-β基因能够明显减轻糖尿病小鼠肾脏的氧化损伤，下调多种细胞因子(内皮素-1、TGF-β、VEGF及结缔组织生长因子)的表达、改善肾小球结构异常、减少蛋白尿的发生。因此提示，抑制PKC-β活化和表达在一定程度上可延缓糖尿病肾脏结构和功能的病理改变。

LY333531是一种PKC-β亚基选择性抑制剂，本实验通过建立糖尿病大鼠模型观察了LY333531对糖尿病大鼠肾功能的保护作用。结果显示，糖尿病大鼠经LY333531灌胃治疗8周后，其内生肌酐清除率和24 h尿蛋白明显低于糖尿病组，提示LY333531可减少糖尿病大鼠尿蛋白排泄，改善肾功能紊乱。其作用可能与LY333531通过抑制PKC-β活化，减少肾脏氧化损伤，下调细胞因子表达，减轻肾脏纤维化和蛋白尿有关[11]。另外，本实验还发现LY组大鼠的肾重/体重低于糖尿病组，提示LY333531对早期糖尿病肾脏肥大有一定的抑制作用。上述结果与Kelly等[12,13]报道LY333531通过抑制PKC活化，下调肾组织中VEGF及TGF-β1表达，改善糖尿病大鼠蛋白尿和肾脏病理变化，以及LY333531能够抑制糖尿病肾脏氧化应激，通过抑制NADPH氧化酶和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性，减少ROS产生，发挥对肾脏保护作用[14]相符合。

综上所述，PKC活化在DN的病理过程中起重要作用。本文结果表明应用PKC-β抑制剂LY333531治疗后，糖尿病大鼠肾功能有所改善，为临床治疗和预防DN提供了实验依据。但DN发病机制极其复杂，LY333531作用靶标和机制尚需进一步研究。

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本文第一作者简介：

伍婷婷(1987-)，女，汉族，硕士研究生，研究方向为糖尿病肾病的分子机制

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4 Satirapoj B. Nephropathy in diabetes [J]. Adv Exp Med Biol, 2012, 771:107-122.

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13 Kelly DJ, Zhang Y, Hepper C, et al. Protein kinase C beta inhibition attenuates the progression of experimental diabetic nephropathy in the presence of continued hypertension[J]. Diabetes, 2003, 52(2):512-518.

14 高 霞, 叶 凤, 周赤燕, 等. PKC-β抑制剂LY333531对糖尿病肾脏NADPH氧化酶与SOD蛋白表达的影响[J]. 首都医科大学学报, 2011, 32(3):392-396.

氢气饱和生理盐水抑制ROS/ NF-κB通路激活、减轻重症急性胰腺炎大鼠肾损伤

本刊副主编，武汉大学人民医院王卫星教授(通讯作者)指导石乔(第一作者)等在《Mediators of Inflammation》(2015，Article ID 685043，3区，IF=3.236)发表了题为“Hydrogen-rich saline attenuates acute renal injury insodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis by inhibiting ROS and NF-κB pathway”的研究论文，主要内容如下：

1 研究背景和目的：氢气能够选择性地清除羟自由基(·OH)及过氧亚硝基阴离子(ONOO-)，不影响机体内正常新陈代谢发生的氧化还原反应及活性氧(ROS)参与的细胞信号通路。重症急性胰腺炎时机体内大量ROS的产生及其激发的炎症级联反应，可损伤肾功能，甚至引起肾衰竭。本研究通过静脉注射氢气饱和生理盐水(HRS)，观察其对重症急性胰腺炎大鼠肾损伤的保护作用，并探讨其保护机制。

2 主要方法：雄性Wistar大鼠72只，随机分为假手术组(SO组)、重症急性胰腺炎组(SAP组)和HRS治疗组(HRS组)，每组24只。胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备重症急性胰腺炎模型。HRS组在造模成功后5min尾静脉注射HRS(6ml/kg),并皮下HRS补液(20ml/kg)。SO组、SAP组造模成功后5min经尾静脉注射生理盐水(6ml/kg),并皮下生理盐水补液(20ml/kg)。术后3、12、24h分批剖杀大鼠，每个时间点8只。分别检测各组大鼠各时间点血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、白细胞介素1β(IL-1β)及IL-6水平。取新鲜肾脏组织检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及髓过氧化物酶(MPO)水平。取肾脏组织病理切片行光镜观察及病理评分。采用免疫组化法检测3-硝基酪氨酸及核因子-κB(NF-κB)在肾脏组织中的表达。Western Blot检测NF-κB、IκB、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10、高迁移率族蛋白1(HMGB1)在肾脏组织中的表达。

3 结果：HRS组大鼠血清AMY水平与SAP组相应时间点差异无统计学意义(P>0.05)；HRS组大鼠血清(术后3h的Cr及BUN除外)Cr、BUN、IL-1β及IL-6较SAP相应时间点显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。HRS组大鼠肾脏MDA、MPO水平较SAP组相应时间点显著降低，SOD活性较SAP组相应时间点显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。胰腺的病理评分及肾脏的病理评分较SAP组相应时间点显著降低(P<0.05)。HRS 12h组肾脏组织中3-硝基酪氨酸、NF-κB(胞核)及TNF-α、HMGB1表达较SAP 12h显著降低。相反，HRS 12h组肾脏组织中IL-10的表达较SAP 12h显著升高(P<0.05)。

4 结论：HRS对重症急性胰腺炎肾损伤具有保护作用，其机制与抗氧化应激、抑制IκB硝化、降解及抑制NF-κB激活，从而减少下游炎性因子的产生有关。

Effects of Protein Kinase C-β Inhibitor LY333531 on Renal Function in Diabetic Rats

WU Ting-ting1, ZENG Ji, ZHANG Bai-fang2, YE Feng2

1Department of Clinical Laboratory, Puai Hospital, Wuhan 430034, China;2Department of Biochemistry, School of Medicine, Wuhan University, Wuhan 430071, China

Objective:To investigate the renoprotective effects of protein kinase C(PKC)-β inhibitor LY333531 in type 1 diabetic rats. Method:Twenty-seven Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into three groups:normal control group, diabetic group and diabetic with LY333531 treatment group. Both of diabetic group and diabetic with LY333531 treatment group rats were injected intraperitoneally with 60 mg/kg streptozotocin (STZ) to induce type 1 diabetes. The LY treatment group rats were treated with LY333531 (10mg/kg/day) for eight weeks by gavage. After carotid artery blood and 24-hour urine of each group collected, blood glucose, creatinine clearance rate and 24-hour urine protein levels were measured. Meanwhile body weight and kidney weight was examined. All the indicators in three groups were analyzed by using statistics. Results:Both diabetic group and LY treatment group rats had higher kidney weight, kidney weight/body weight, blood glucose and 24-hour urine protein levels than normal control group (P<0.05). But body weight in diabetic group and LY treatment group rats were lighter than normal control group (P<0.05).The kidney weight/body weight, creatinine clearance rate and 24-hour urine protein levels of LY treatment group rats were significantly decreased compared with diabetic group (P<0.05). Besides, there was no significant difference in kidney weight, body weight and blood glucose between LY treatment group and diabetic group (P>0.05). Conclusion:The PKC-β inhibitor LY333531 may be used therapeutically to improve creatinine clearance rate and proteinuria of type 1 diabetic rats.

Diabetes; Protein kinase C-β inhibitor LY333531; Renal function; Rat

武汉市卫计委科研基金项目(WX13C17)

1武汉市普爱医院检验科，武汉 430034；2武汉大学基础医学院生物化学与分子生物学系，武汉 430071

本文2015-03-23收到，2015-06-12修回

R587.1

A

1005-1740(2015)03-0013-04