p53表达下调对saRNA介导p21基因激活的影响研究

吴嘉 陈忠 杨为民 汪成合 盖强强 胡嘏

·实验研究·

p53表达下调对saRNA介导p21基因激活的影响研究

吴嘉 陈忠 杨为民 汪成合 盖强强 胡嘏

目的研究抑制p53基因的表达是否影响小双链RNA(dsRNA)分子dsP21-322对p21基因表达的激活效应。方法体外培养人肾癌ACHN细胞(p53野生型)和膀胱癌5637细胞(p53突变型)。采用RT-PCR方法筛选具有抑制p53基因表达的干扰RNA分子dsP53-3。人工合成具有激活效应的dsRNA分子dsP21-322，以及与人体已知RNA序列无同源性的阴性对照小dsRNA分子dsCon。将上述dsRNA分子转染到两种肿瘤细胞中，每种细胞均分为5组，即：①空白组；②阴性对照组；③dsP21-322单转染组；④dsP53单转染组；⑤dsP21-322与dsP53共转染组。通过荧光染色检测转染效率，采用Real-time PCR和Western-blot技术检测各组细胞中p53和p21转录和翻译水平上的表达差异。结果①在单转染组中，dsP21-322能够激活ACHN细胞、5637细胞中p21基因表达；②dsP53-3能够抑制ACHN细胞、5637细胞中p53基因表达；③在共转染组中ACHN细胞、5637细胞中p53基因下调，而dsP21-322依然能够激活p21基因表达。结论外源合成的 saRNA 分子dsP21-322能激活ACHN细胞、5637细胞中p21基因表达，该激活效应不受p53蛋白表达量的影响。

siRNA ； saRNA； RNA干扰； RNA激活

p21基因是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子，它负调节着细胞周期中由G1期过渡到S期的变化。文献报道p21基因表达调控有两个路径[1]，即p53依赖途径和p53非依赖途径。我们前期研究发现针对p21基因启动子序列设计与其互补配对的小双链RNA(dsRNA)分子dsP21-322能在基因转录水平激活p21基因表达[2]，但这个基因激活过程是否需要p53蛋白的参与尚不清楚。本文研究分别抑制含有野生型或突变型p53蛋白的细胞株，采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制p53蛋白表达后，对dsP21-322激活p21效应是否产生影响。现报告如下。

材料与方法

一、材料与试剂

肾癌ACHN细胞(p53 野生型)、膀胱癌5637细胞(p53 突变型)为本院泌尿外科研究所保种培养；SYBR Premix Ex TapTMⅡ(TaKaRa公司)，脂质体LipofectamineTM2000、引物合成和Opi-MEM培养液(Invitrogen公司)，DMEM高糖型培养液、RPMI1640培养液(GIBICO公司)，RNA提取试剂盒(Axygen公司)，ReverTra Ace-α-TM(TOYOBO公司)，dsRNA合成由广州锐博生物有限公司提供；p21与p53抗体(CST公司)。

二、dsRNA的合成

人工合成与p21基因启动子区-322位点相对应的saRNA片段以及同样长度的与体内已知RNA序列无同源性的阴性对照dsRNA分子dsCon。针对p21基因启动子区上游-322bp位点起始的dsRNA分子dsP21-322，其序列为：dsP21-322-S:5′-CCAACUCAUUCUCCAAGUAdTdT；dsP21-322-AS：dTdTGGUUGAGUAAGAGGUUCAU-5′。同样长度的与体内已知RNA序列无同源性的阴性对照dsRNA分子dsCon的序列为：dsControl-S：5′-ACUACUGAGUGACAGUAGAdTdT；dsControl-AS：dTdTUGAUGACUCACUGUCAUCU-5′，cy3标记正义链3′端，可荧光显色。广州锐博生物有限公司提供3个针对p53基因mRNA用于干扰p53基因的siRNA，分别为dsP53-1、dsP53-2、dsP53-3。

三、细胞培养与转染

膀胱癌细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液，肾癌ACHN细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，在CO2培养箱内(37 ℃、5%CO2、饱和湿度)连续培养、传代。为提高转染效率，拟转染前两代用无双抗的培养液培养,用0.25% Trypsin (胰蛋白酶)-0.02% EDTA (依地酸二钠)消化后吹打成单细胞悬液，以4×105个/孔的密度接种于6孔板中，加入2 ml无双抗培养液震荡使细胞分布均匀。6孔板种植细胞(8～10)×104/L，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液或含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养24 h，细胞汇合度达到50%左右。将稀释好的dsRNA和 Lipofectamin2000 试剂混合，形成dsRNA/Lipofectamin2000复合物。将dsRNA转染载体加到含有细胞和Opi-MEM培养液的培养板的孔中融合，然后放入37 ℃的CO2培养箱培养。6 h后换含10%胎牛血清的RPMI1640培养液或含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，荧光显微镜下观察细胞红色荧光素的分布以检测转染效率。

四、dsP53沉默效应的测定及筛选

在dsP53-1、dsP53-2、 dsP53-3中筛选出能够沉默p53基因并效应最强的一个siRNA序列用于之后共转染的实验。以膀胱癌5637细胞进行筛选测定，将dsP53-1、dsP53-2、 dsP53-3分别稀释后与Lipofectamine2000试剂混合，形成siRNA/ Lipofectamine2000复合物，再将转染复合物加入到各个含有膀胱癌5637细胞与Opi-MEM培养液的培养板孔中，使siRNA浓度为50 nmol，总体积为2 ml，然后放入37 ℃的CO2培养箱培养。6 h后换含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，荧光显微镜下观察细胞红色荧光素的分布以检测转染效率。培养板板中各孔分成3组：①空白组，只加入Lipofectamine2000试剂； ②阴性对照组，加入dsRNACon 和Lipofectamine2000试剂；③实验组, 分别加入dsP53-1、dsP53-2、 dsP53-3和Lipofectamine2000试剂形成的siRNA/ Lipofectamine 2000复合物于3个孔中，48 h后提取总RNA，逆转录后行Real-time PCR观察p53沉默效应，从中选出效应最强的一个参与后续试验。

五、p53是否参与dsP21-322激活p21基因的测定

将dsP53、dsP21-322、dsCon稀释后与Lipofectamine2000试剂混合，形成dsRNA/Lipofectamine2000复合物，再将转染复合物加入到各个含有细胞和Opi-MEM培养液的培养板孔中，使dsRNA浓度为50 nmol，然后放入37 ℃的CO2培养箱培养。6 h后换含10%胎牛血清的RPMI1640培养液或含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，荧光显微镜下观察细胞红色荧光素的分布以检测转染效率。培养板板中各孔分成5组: ①空白组，只加入Lipofectamine2000试剂； ②阴性对照组，加入dsCon 和Lipofectamine2000试剂； ③实验组1，加入dsP53和Lipofectamine2000试剂； ④实验组2，加入dsP21-322和Lipofectamine2000试剂；⑤实验组3，加入dsP53、dsP21-322和Lipofectamine2000试剂。调整dsRNA终浓度为50 nmol，总体积为2 ml。48 h后提取RNA，逆转录后行Real-time PCR观察p53与p21的转录水平差异，72 h后提取蛋白行Western-blot观察两者翻译水平差异。

六、总RNA的提取与逆转录

运用从Axygen公司购买的RNA提取试剂盒提取总RNA。各样本取2 ng～2 μg总RNA，按ReverTra Ace-α-TM(TOYOBO公司)说明进行逆转录合成cDNA。

七、Real-time PCR与Western-blot

应用实时荧光定量PCR检测，GAPDH基因作为内参对照。反应体系为20 μl总体系，反应条件95 ℃ 3 min预变性，循环内95 ℃ 10 s变性，55 ℃退火30 s，PCR反应设置39个循环，并在每个循环延伸末端点收集荧光信号，绘制扩增曲线。所用p53引物为Forward primer：CGTCAGAAGCACCCAGGACT；Reverse primer：CATCCTCCTCCCCACAACAA。p21基因的引物为Forward primer：TCCTCTAGCTGTGGGGGTGA；Reverse primer：GAAGGTCGCTGGACGATTTG。GAPDH基因引物为Forward primer：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG；Reverse primer：AGGGGCCATCCACAGTCTTC。

冷PBS洗涤细胞两次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min收获蛋白。将抽提蛋白用BCA法定量后, 于100 V泳道进行SDS-PAGE; 电泳结束后,以30 mA ,120 min 将蛋白转移至NC膜; 封闭液(5%BSA/TBST) 封闭60 min, 加入一抗(1∶3 000) 4 ℃过夜, 二抗(1∶6 000) 室温下杂交120 min, TBST洗膜三次后用ECL试剂盒进行发光反应, 压片、显影、定影, 观察蛋白印迹, 并进行图像分析。

八、统计学方法

实验数据应用SPSS 19.0统计分析软件分析检验。计量资料均采用均数±标准差来描述，两组间采用t检验，多个不同处理组组内、组间计量资料的比较应用单因素方差分析。取双侧为检验标准，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、dsP53 的沉默效应测定

经Real-time PCR测定，dsP53-1、dsP53-2、 dsP53-3对p53均有沉默作用，其中dsP53-3的沉默效应最为明显(图1)，其序列为：5′-CUACUUCCUGAAAACAACGdTdT-3′，用于本研究的后续工作。

二、dsP53与dsP21-322共转染对p53和p21基因在转录水平上的影响

经Real-time PCR测定，如图2所示：①在dsP21-322单转染组中，dsP21-322能够激活ACHN细胞、5637细胞中p21基因表达；②在dsP53单转染组中，dsP53能够抑制ACHN细胞、5637细胞中p53基因表达；③在dsP21-322与dsP53共转染组中，ACHN细胞、5637细胞中p53基因下调，而p21基因的表达仍上调，提示在p53基因表达受到抑制的情况下，dsP21-322依然能够激活p21基因。

图1 不同siRNA分子抑制5637细胞p53基因表达

图2 抑制p53基因表达对dsP21-322激活效应影响

三、dsP53与dsP21-322共转染对p53和p21基因在翻译水平上的影响

经Western-blot测定，如图3、4所示：①dsP21-322能够激活ACHN细胞、5637细胞中p21基因表达，两个细胞株中的p21蛋白均上调；②dsP53能够沉默ACHN细胞、5637细胞中p53蛋白表达；③两种细胞株中p53蛋白表达下调不影响dsP21-322分子对p21基因的激活效应。

图3 抑制p53蛋白表达对5637细胞p21基因激活效应影响

图4 抑制p53蛋白表达对ACHN细胞p21基因激活效应影响

讨 论

肿瘤的发生、发展与基因的异常表达或失活有关。近年的研究发现RNA分子能在多个水平参与基因表达的调控，如RNAi，即将目的基因所对应的dsRNA导入细胞，导致相应的mRNA 降解，从而阻断特定基因的表达；另有报道dsRNA可使相应基因启动子区域DNA的同源序列段CpG岛发生甲基化，并导致相应的基因失去转录活性，造成特定基因沉默[3-4]。这些技术或方法可以特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，因而可用于肿瘤治疗。

RNA激活(RNA activation, RNAa)是近年来新发现的由dsRNA直接激活目的基因的一种新的基因表达调节机制，这些dsRNA被称为“小分子激活RNA(saRNA)，它们起到与RNAi相反的作用效果[5-6]。在人体内也同样具有内源性的microRNA产生RNAa效应[7]。RNAa的发现具有重要的理论和实践意义[8-9]：①丰富了dsRNA参与基因表达调控理论，是RNAi理论的重要补充；②RNAa可用于多种疾病的治疗，特别是肿瘤疾病(如通过特异性激活一系列抑癌基因)、心血管疾病(如激活血管内皮细胞生长因子用于冠心病的治疗)、代谢及遗传性疾病，并且在干细胞的定向激活和分化方面，RNAa可以做到RNAi不能完成的工作。

p21基因表达调控有两个路径，即依赖p53途径和非依赖p53途径。前者中，p53 通过与p21基因启动子上游分别位于2 400 bp 和8 000 bp 处的两个p53 蛋白结合区的特异性结合而诱导p21基因的表达；后者中，Sp1/Sp3和转化生长因子β(TGF-β)在p21基因启动子区-119位点附近特异性结合诱导p21基因的表达。然而我们所设计的针对p21基因启动子-322位点的saRNA(dsP21-322)的核酸序列并不与p53蛋白诱导p21基因表达的结合位点一致。

p53基因分为野生型和突变型两个亚型，文献报道只有野生型p53蛋白方能促进p21基因的表达[10]。本实验选取肾癌ACHN细胞、膀胱癌5637细胞两个细胞株正是因为肾癌ACHN细胞中p53基因为野生型，而膀胱癌5637细胞中p53基因为突变型。从实验结果看，外源合成的saRNA 分子dsP21-322均能激活两者p21基因的表达。无论p53基因是野生型还是突变型，当p53表达受到抑制时，均不影响dsP21-322介导的p21基因激活效应。

目前 RNAa已得到国际上越来越多学者的认可，虽然p53是否直接或间接参与这一激活过程还不得而知，但本研究表明dsP21-322的激活效应不受p53蛋白的影响。dsP21-322激活p21基因的详细机制并不十分清楚，还需要进行更为广泛而深入的研究。

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(本文编辑：徐汉玲)

Affect of down-regulation of expression of p53 gene to saRNA activate p21 gene

WUJia,CHENZhong,YANGWei-min,WANGCheng-he,GEQiang-qiang,HUJia.DepartmentofUrology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

Correspondingauthor:CHENZhong,E-mail：chenzhongtj@126.com

Objective To investigate the effect of down-regulation of expression of p53 gene on saRNA activate p21 gene. Methods Culturey human kidney cancer cell line ACHN (wild-type p53) and human bladder cancer cell line 5637(mutant p53) in vitro. Synthesized the sequence-specific corresponding saRNA fragments of the promoter of p21 gene, sequence-specific corresponding siRNA fragments of mRNA of p53 gene，and negative control small dsRNA dsCon. Co-transfected into human kidney cancer cell line ACHN and human bladder cancer cell line 5637 in vitro, respectively with lipofecta-mine reagent, Real-time PCR and Western-blot were performed to examine the difference expression level of p53 and p21 in each group. Results ①p21 gene expression in human kidney cancer cell line ACHN and human bladder cancer cell line 5637 significantly increased. ②p53 gene expression in human kidney cancer cell line ACHN and human bladder cancer cell line 5637 significantly declined. ③when p53 gene down regulated in human kidney cancer cell line ACHN and human bladder cancer cell line 5637,p21 gene expression significantly increased. Conclusions Synthetic saRNA dsP21-322 can activate both the p21 gene in human kidney cancer cell line ACHN and human bladder cancer cell line 5637, when the p53 gene is down regulated , regardless of the p53 gene is wild-type or mutant , did not affect the dsP21-322 to activate the p21 gene.

siRNA ； saRNA； RNA interference； RNA activation

430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科

陈忠，E-mail：chenzhongtj@126.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2015.06.009

2015-11-17)