DDR2在肾透明细胞癌中的表达及意义

王雷 王阳 吴小荣 沙建军 陈勇辉 薛蔚 薄隽杰 刘东明 黄翼然

·实验研究·

DDR2在肾透明细胞癌中的表达及意义

王雷 王阳 吴小荣 沙建军 陈勇辉 薛蔚 薄隽杰 刘东明 黄翼然

目的探讨盘状结构域受体2(DDR2)在肾透明细胞癌与正常肾组织中的表达及其临床意义。方法分别采用免疫组织化学染色和Real-time PCR检测DDR2在肾透明细胞癌及相应癌旁正常肾组织中的表达，进一步分析其表达与肾透明细胞癌相关临床病理特征间的关系。结果肾透明细胞癌组织中DDR2蛋白及mRNA与癌旁组织比较均呈现异常低表达(P<0.05),且肾透明细胞癌组织中DDR2的表达与肾癌临床分期及组织学分级呈负相关(P<0.05)。结论DDR2在肾透明细胞癌组织中的表达较正常肾组织低，且其表达量与肾癌的临床分期和病理分级呈负相关，提示DDR2可能在肾透明细胞癌中扮演抑癌基因的角色,但具体机制还需进一步深入研究。

【关键词】肾透明细胞癌； DDR2； 抑癌基因

肾癌又称肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC), 主要起源于肾小管上皮细胞，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占成人所有恶性肿瘤的2%～3%[1]，最主要的病理类型是肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，约占肾癌的70%～85%[2]。目前肾癌的治疗以手术为主，但仍有20%～40%的患者术后出现肿瘤复发。尽管目前靶向药物治疗可以延长晚期肾癌患者的生存时间，但因肾癌对放疗、化疗等其他治疗方式效果不佳，整体预后较差。因此研究肾癌的病因学对肾癌的早期诊断、治疗和预后至关重要。

盘状结构域受体2(discoidin domain receptor 2，DDR2)是一种受体型蛋白酪氨酸激酶，能特异性地和一系列胶原配体(Ⅰ～Ⅲ、Ⅹ型胶原)相结合并被胶原激活，进而发挥一系列的生物学作用[3]。本研究应用免疫组织化学染色法和Real-time PCR研究DDR2在ccRCC及正常肾组织中的表达情况,以期对DDR2在ccRCC发生、发展中的作用及预后意义的研究提供帮助。

材料与方法

一、一般资料

取2013年4月至2015年3月泌尿外科行手术治疗的87例ccRCC患者的癌组织及其中53例患者的正常肾脏组织标本作为研究对象，均经病理证实。87例ccRCC患者中，男24例，女63例，年龄26～78岁。所有患者术前均未接受任何治疗，且排除转移性RCC。收集患者性别、年龄、肿瘤大小、病理分级、分期(根据AJCC 2009标准)情况等资料。

二、主要试剂

一抗为多克隆兔抗人DDR2抗体(H-108：sc-8989, 美国Santa Cruz Biotechnology), 二抗为辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(美国DAKO公司)。RNA提取试剂Trizol购自 Invitrogen 公司；RT试剂盒购自Fermentas 公司；Premix Taq©Version 2.0 PCR扩增试剂盒购自TAKARA公司；引物均由上海生工生物技术有限公司合成。

三、Real-time PCR

四、免疫组织化学染色

将收集到的肾癌组织蜡块标本制成4 μm切片，经脱蜡、水化后置入柠檬酸缓冲液中高温高压进行抗原修复。过氧化物酶阻断剂覆盖样品5～10 min，封闭内源性过氧化物酶。PBS液漂洗3次×5 min；绵羊血清阻断剂覆盖样品15 min后弃去，以卵白素阻断试剂孵育样品，持续15 min后PBS缓冲液冲洗样品3次×5 min，加入生物素阻断试剂孵化样品，持续15 min后PBS缓冲液冲洗样品3次×5 min。DDR2抗体(1∶500)湿盒中孵育样品，4 °C冰箱过夜，次日生物素标记的抗兔二抗(1∶5 000)37 ℃孵育20 min、SABC 37 ℃孵育 20 min ，最后滴加DAB显色5 min，苏木素复染后脱水封片。PBS代替一抗作阴性对照。

DDR2阳性结果判断标准：细胞质及包膜内出现淡黄色至棕黄色染色为阳性细胞，随机选择5个高倍镜视野(×200)进行判断。结果判定：染色强度阴性为0分，淡黄色染色计1分，中度黄色染色计2分，棕黄色强染色计3分；同时对阳性细胞百分比进行评分(0～100%)：无阳性细胞计0分，1%～30%计1分，31%～60%计2分，>60%计3分。上述两项相乘，总分0～3为低表达，4～9分为高表达。

五、统计学方法

结 果

一、免疫组化染色法评估DDR2蛋白在ccRCC及癌旁正常肾组织中的表达情况

癌旁正常肾脏组织中均可见 DDR2蛋白呈强阳性表达,而肾癌组织中DDR2蛋白染色为阴性。DDR2蛋白表达定位于近端肾小管细胞质内，而在ccRCC中正常的肾小管组织消失而代之以结构紊乱的癌细胞组织，癌细胞核内DDR2蛋白明显降低(图1)。

A:正常肾脏组织中DDR2呈阳性表达;B～D分别为FuhrmanⅠ、Ⅱ、Ⅲ级ccRCC中DDR2的弱表达或阴性表达图1 DDR2在癌旁组织及不同ccRCC Furhman分级中的表达情况

二、ccRCC及癌旁组织中DDR2 mRNA的表达

为了进一步了解DDR2表达下降是否与其转录水平的调控有关,应用 Real-time PCR方法,检测12对ccRCC及相应患者的正常肾组织标本DDR2 mRNA的表达变化。结果在肾癌组织中，DDR2 mRNA的相对表达量(0.006±0.005 3)明显低于相应的正常肾组织的mRNA表达量(0.014 6±0.006 1)(P<0.05)，且ccRCC组织中DDR2 mRNA只有很微弱的表达(t=3.559,P=0.004 5)。表明ccRCC组织中DDR2 mRNA 的表达水平显著降低(图2),差异有统计学意义。提示DDR2基因表达在转录水平可能受到了抑制。

图2 ccRCC与正常肾组织 DDR2 mRNA 表达水平比较

三、DDR2表达情况与肾癌患者临床特征的关系

DDR2表达情况与肾癌患者临床特征的关系见表1。

讨 论

RCC是泌尿系常见肿瘤，且其发病率逐年上升，因此积极寻找协助RCC早期诊断的分子标志物显得尤为重要。尽管已有研究发现不少生物分子标志物与肾肿瘤的发生、发展及预后存在相关性，如缺氧诱导因子、血管内皮生长因子、碳酸酐酶Ⅸ等[4]，但仍未能明确解释RCC的发生、发展机制。

DDR2蛋白是一种受体型蛋白酪氨酸激酶，能被Ⅰ～Ⅲ、Ⅹ型胶原磷酸化而激活，参与调控细胞增殖、粘附、迁移及细胞外基质重建，在人体多种病理生理过程中都发挥重要作用。上皮细胞向间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是恶性实体瘤中细胞浸润转移的一个重要途径，在多种肿瘤的原发性浸润和继发性转移中都起着举足轻重的作用。近年来研究发现在EMT进程中，恶性肿瘤细胞可以获得更大的侵袭力，更容易侵袭到周围组织或发生血流转移。而Walsh 等[5]发现DDR2及其配体Ⅰ型胶原通过调节转化生长因子β1(TGF-β1)参与了EMT进程。已有不少研究发现DDR2在不少肿瘤中差异性表达。在头颈部鳞癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等一些恶性肿瘤中已发现DDR2的表达增高，且DDR2的高表达与这些恶性肿瘤的进展和不良预后是密切相关的[6-9]。Ren等[6]在乳腺癌细胞系中发现缺氧环境能增加DDR2的表达和磷酸化水平，体外乳腺癌肿瘤模型实验得出敲除DDR2后能显著减少乳腺癌的肺和淋巴结转移；进一步的机制研究发现DDR2缺氧环境下通过激活ERK1/2 MAPK通路在诱导乳腺癌细胞发生转移、侵袭和EMT中发挥必不可少的作用。DDR2可能作为癌基因在恶性肿瘤的发生、发展中起着重要作用。

表1 ccRCC中DDR2 蛋白表达与临床病理学特征的关系

有不少关于DDR2在肺癌中表达情况的研究。Ford等[10]利用qRT-PCR实验研究了146例非小细胞肺癌患者标本中DDR2的表达，发现DDR2在肺癌中的表达低于正常肺组织。随后日本学者Sasaki 等[11]对166例非小细胞肺癌患者中DDR2的突变及表达情况进行了研究，他们亦得出DDR2在非小细胞肺癌中的表达是降低的，但是在某些晚期肺癌(8.4%)患者中DDR2的表达水平高于正常肺组织。然而，在RCC中还没有关于DDR2表达情况的研究报道。

本研究首次从mRNA及蛋白质水平检测了DDR2在ccRCC及其癌旁正常肾脏组织中的表达情况，发现DDR2在ccRCC中的表达是降低的，而且DDR2的低表达与ccRCC的临床进展具有相关性，且ccRCC的Fuhrman分级和TNM分期越高，DDR2的表达越低。这些都提示DDR2的低表达与肾癌的发生、发展具有一定的关系，我们推测和肺癌中相似，DDR2可能在ccRCC中扮演抑癌基因的角色，但是具体的机制还不明确。

综上所述，DDR2在ccRCC中的表达明显低于癌旁正常肾脏组织，且其表达量与肾癌的临床分期和病理分级呈负相关，提示DDR2可能在ccRCC中扮演抑癌基因的角色。但是具体的分子机制还需行进一步的实验研究。另外本实验样本量也不大，仍需国内外多中心、大样本的实验来证实。

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[5] Walsh LA, Nawshad A, Medici D. Discoidin domain receptor 2 is a critical regulator of epithelial-mesenchymal transition[J]. Matrix Biol,2011,30(4):243-247.

[6] Ren TT, Zhang W, Liu XP, et al. Discoidin domain receptor 2 (DDR2) promotes breast cancer cell metastasis and the mechanism implicates epithelial-mesenchymal transition programme under hypoxia[J]. J Pathol，2014,234(4):526-537.

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[11] Sasaki H, Shitara M, Yokota K, et al. DDR2 polymorphisms and mRNA expression in lung cancers of Japanese patients[J]. Oncol Lett,2012,4(1):33-37.

(本文编辑：徐汉玲)

Expression and clinical significance of DDR2 protein in clear cell renal cell cancer

WANGLei*,WANGYang,WUXiao-rong,SHAJian-jun,CHENYong-hui,XUEWei,BOJuan-jie,LIUDong-ming,HUANGYi-ran．*DepartmentofUrology,RenJiHospital,SchoolofMedicineShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200001,China

Correspondingauthor:LIUDong-ming,E-mail:liudm541@126.com

Objective To explore the expression of DDR2 in clear cell renal cell carcinoma(ccRCC) and normal renal tissues,and analysize its clinical significance. Methods The expression of DDR2 protein in specimens of ccRCC and adjacent normal renal tissues were detected by immunohistochemistry and qRT-PCR，their correlations of clinicopathologic features were analyzed． Results DDR2 protein and mRNA levels were abnormally decreased in ccRCC when compared with adjacent normal renal tissues(P<0.05),which showed negative correlation with ccRCC TNM stages and ccRCC clinic stages(P<0.05). Conclusions The expression of DDR2 were decreased in ccRCC and had relationship with clinical stage and histological grade,which indicated that DDR2 may play a role as tumor suppressor gene in ccRCC.However,further studies are needed to confirm these findings.

Clear cell renal cell carcinoma; DDR2; Tumor suppressor genes

200001 上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科(王雷、吴小荣、沙建军、陈勇辉、薛蔚、薄隽杰、刘东明、黄翼然)；江西省抚州市临川区人民医院泌尿外科(王阳)

刘东明，E-mail：liudm541@126.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2015.06.010

2015-11-20)