超声辅助咪唑离子液提取酸枣仁中黄酮的探索

2015-03-02王秀玲王僧虎成丽萍

邢台学院学报 2015年4期

关键词：乙醇溶液酸枣仁固液

王秀玲，李敏，王僧虎，成丽萍

（邢台学院化学工程与生物技术学院，河北邢台 054001）

超声辅助咪唑离子液提取酸枣仁中黄酮的探索

王秀玲，李敏，王僧虎，成丽萍

（邢台学院化学工程与生物技术学院，河北邢台 054001）

以咪唑类离子液体的乙醇溶液为提取剂，利用超声波辅助提取脱脂酸枣仁中的黄酮，并且用高效液相色谱仪测定。在单因素实验的基础上，探讨提取剂种类、提取剂浓度、超声时间、固液比对提取率的影响。结果表明，最佳实验条件:提取剂为[Hmim]Br、提取剂体积浓度为[Hmim]Br与乙醇的体积比为1∶6、超声时间30min、固液比为1∶50。在最优条件下测定不同地区酸枣仁中的黄酮。该提取方法操作简单快速，定量结果准确可靠且绿色环保。

酸枣仁；离子液体；超声提取；黄酮

酸枣仁（Semen Zizyphi Spinosar，SZS）是鼠李料（Phamnaceae）植物枣酸 [zizyphus jujuba Mill.var spinosa(Bunge)HuexH.F.chou]的干燥成熟种子[1]。北方干旱的丘陵和山区等地种植的较多，是一种常用的安神药。适用于经常失眠、身体虚弱、惊悸多梦、津少口渴的人群。研究表明，酸枣仁中含有多种物质，比如脂肪油、皂苷、黄酮、蛋白质等[2]，其中最主要的有效成分之一为黄酮类物质[3]。提取黄酮的方法有超声波辅助提取法、微波辅助法、溶剂提取法等。超声提取以其温度低、提取率高、提取时间短的独特优势被用来提取中药材和各种动、植物中的有效含量[4]，是替代传统的工艺方法来实现节能高效、简便环保式提取的现代高新技术手段。常用提取剂为有机溶剂，会造成环境污染；虽然超声波和微波辅助提取法优于溶剂提取的速度，但提取率仍然不高。离子液体作为一种新型的绿色溶剂倍受研究者的关注。离子液体具有以下特性及应用： (1)无味、不可燃、不挥发，对环境的污染小； (2)导电性强，可作为电解液应用于电化学领域； (3)溶解能力强，可以用作提取剂或有机反应的溶剂； (4)热化学性质稳定，纳米材料领域也可被应用[5]。本文研究了以咪唑类离子液体1-己基-3-甲基咪唑溴化盐（[Hmim]Br）乙醇溶液为提取剂，结合超声波辅助提取的新型提取体系，采用高效液相色谱法测定脱脂酸枣仁中的黄酮。该样品的前处理方法操作简便快速，提取率高，而且对环境无污染。本研究也为酸枣仁的加工处理及综合开发利用奠定了可靠稳固的基础。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

实验仪器：脱脂装置；FA2004电子天平（上海天平仪器技术有限公司）；TD-4台式离心机（湖南仪器仪表总厂离心机厂）；KQ-50E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪（HPLC）。

实验试剂：1-丁基-3-甲基咪唑溴盐（[Bmim] Br），1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[Bmim] BF4），1-己基-3-甲基咪唑溴盐（[Hmim]Br），1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[Hmim]BF4），以上试剂为实验室合成，经检测含量在98%以上；无水乙醇，磷酸（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；槲皮素（纯度均≥98%）；甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；酸枣仁（市售）。

1.2 检测条件

HPLC色谱条件为[6]：采用WondaSilTM－C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相A和流动相B梯度洗脱，A为0.1%磷酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0~5.5min，45%~64%B；5.5~14min，64%B；14~18min，64%~45%B。流速：1.0mL· min-1；进样量：20μL；检测波长：257nm；柱温：34℃。

标准曲线：准确称取槲皮素标准品0.100g，用少量离子液体溶解，转入100mL容量瓶中稀释定容，摇匀，得到浓度为1mg·mL-1槲皮素标准溶液。再稀释成 0.0025mg·mL-1、0.05mg·mL-1、0.01mg·mL-1、0.02mg·mL-1、0.03mg·mL-1槲皮素标准溶液，采用HPLC法测定峰面积。以峰面积为纵坐标，槲皮素浓度为横坐标制作标准曲线。结果显示槲皮素在2.500~30.00μg·mL-1的范围内呈良好的线性关系，回归方程为：y=6×107x+ 29001，R2=0.9952，式中x为质量浓度（mg·mL-1），y为峰面积。

1.3 供试品溶液的制备

将酸枣仁用小钢磨打碎，取10g放250mL蒸馏烧瓶中，同时向蒸馏烧瓶中加入120mL石油醚，连接仪器，利用索氏提取器脱脂酸枣仁约4小时。

将脱脂的酸枣仁置于干燥箱中60℃条件下干燥，粉碎，过60目筛（0.25mm），干燥条件下保存备用。准确称取脱脂酸枣仁粉末0.1g，加3mL 1.0mol/L的 [Bmim]Br乙醇溶液，超声提取45min，离心5min，取上层清液经0.45μm有机膜过滤，进样分析。

2 结果与讨论

2.1 离子液体的合成

采用两步法合成离子液体，先用1-甲基咪唑与卤代烷反应合成中间体溴盐（溴化1-烷基-3-甲基咪唑，烷基=正丁基、正己基，分别简记为[Bmim]Br、 [Hmim]Br），第二步再将溴离子置换为目标产物的阴离子，合成系列离子液1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（烷基=正丁基、正己基，分别简记为 [Bmim]BF4、 [Hmim]BF4）。

2.2 提取剂种类的选择

提取剂的种类对提取率有很大的影响。本实验分别采用 [Bmim]Br、 [Bmim]BF4、 [Hmim] Br、 [Hmim]BF4的乙醇溶液为提取剂，在体积比V[Hmim]Br∶V乙醇为1∶6，固液比为1∶50，超声时间为30min的条件下比较了不同提取剂对酸枣仁中黄酮的提取率的影响，结果如图1所示。从图中可以看出 [Hmim]Br的乙醇溶液为提取剂时，提取率高于其他3种。具有相同阳离子的 [Bmim] Br、 [Bmim]BF4和 [Hmim]Br、 [Hmim]BF4的提取率不同，是因为阴离子的种类对提取率有所影响。阳离子相同、阴离子不同的咪唑类离子液体的表面张力变化范围也较大，通常阴离子的质量影响着表面张力，表面张力随阴离子质量的增加而增大[7]。此外，具有相同阴离子结构的[Bmim] Br、 [Hmim]Br和 [Bmim]BF4、 [Hmim]BF4两对离子液体对黄酮的提取率相差较多，这说明阳离子结构对黄酮提取率的影响更大，这是因为[Hmim]+比 [Bmim]+的碳链长，碳链越长非极性越强，根据“相似相溶”原理，对黄酮的溶解能力越强，从而提高黄酮的提取率。故本实验选择[Hmim]Br为提取剂。

图1 离子液种类对黄酮提取率的影响

2.3 提取试剂浓度的选择

以 [Hmim]Br的乙醇溶液为提取剂后，考察了不同体积浓度的 [Hmim]Br的乙醇溶液（V[Hmim]Br∶V乙醇=1∶3，1∶6，1∶9，1∶15）对提取率的影响，在固液比为1∶50，超声时间为30min的条件下，实验结果如图2。由图可知，随着 [Hmim]Br体积浓度的增大，提取率也相应的增大，当[Hmim]Br与乙醇的体积比为1∶6时，提取率达到最大。之后提取率却不再增大反而减小，是因为随着 [Hmim]Br体积浓度的增大，提取剂的溶解能力和提取能力也在增强。当达到1∶6后，[Hmim]Br的浓度比较大，溶液的黏度较大，扩散能力差，提取率低。故本实验选择 [Hmim]Br与乙醇体积比为1∶6的溶液作为提取剂。

图2 不同离子液体浓度对黄酮提取率的影响

2.4 超声提取时间的选择

为了取得最佳提取效果，本实验还考察了超声提取时间（15min，30min，45min，60min）对提取率的影响。在 [Hmim]Br与乙醇体积比为1∶6的溶液作为提取剂，固液比1∶50的条件下，不同提取时间对黄酮提取率的影响结果如图3。其提取率先上升后下降，在30min时达到最大，30min之后提取率明显降低。其原因是，随着提取时间的不断增加，提取体系的温度也随之升高，从而影响提取效果。超声波提取是利用辐射产生的强烈空化效应、扰动效应、击碎和搅拌作用等多级效应，加速有效成分的溶解。在此过程中，首先，随着提取时间的增加，酸枣仁中黄酮溶解，使提取率增加；其次，随着提取时间继续增加，空化效应、击碎效应会增大黄酮的分解速率，因此测定的黄酮含量减少[8]。所以本实验最终选择的超声提取时间为30min。

2.5 固液比的选择

图3 不同超声时间对黄酮提取率的影响

固液比的选择对提取率有着重要的影响。本实验考察了不同的固液比对提取率的影响，在超声提取时间为30min， [Hmim]Br的乙醇溶液为提取剂且V[Hmim]Br∶V乙醇=1∶6的条件下，不同固液比对黄酮的提取率的影响如图4。由图可以看出当固液比分别为从1∶10增加到1∶50时，提取率逐渐升高。一般情况下，样品用量一定时，所用溶剂越多，酸枣仁颗粒周围的浓度越低，细胞壁内外两侧的浓度差越大，黄酮物质的扩散速度越快，加快了黄酮物质的溶出速度[9]。因此，在1∶10~1∶50g/mL范围内，提取率增加。当固液比在1∶50~1∶60g/mL酸枣仁中黄酮的提取率反而降低。原因是由于增大的溶剂用量对超声波能量的吸收增加，从而使植物细胞吸收超声波能量的能力减弱，细胞壁不能完全破裂，黄酮类化合物不从能酸枣仁中很好的溶解出来，导致黄酮的提取率降低[10-12]。

图4 不同液固比对黄酮提取率的影响

2.6 无水乙醇与离子液提取黄酮的对比

称取相同质量的酸枣仁，超声时间为30min、固液比为1∶50的条件下，以乙醇为提取剂与以[Hmim]Br的乙醇溶液为提取剂进行对比实验，如图5。用离子液提取酸枣仁的提取效果明显比只用乙醇提取的效果好，原因是离子液自身独特的结构使黄酮从酸枣仁中更好的提取出来，因此离子液更有优势。

2.7 不同产地酸枣仁中黄酮的提取

图5 无水乙醇与离子液对黄酮提取率的影响

图6 不同产地的酸枣仁黄酮提取率的对比

在提取剂为 [Hmim]Br、提取剂体积浓度为[Hmim]Br与乙醇的体积比为1∶6、超声时间为30min、固液比为1∶50的最优实验条件下考察不同产地的酸枣仁中所含的黄酮。结果如图6，产地为邢台的酸枣仁提取出的黄酮较多。原因可能为酸枣适宜生长在温暖干燥的环境，耐寒、耐碱，不耐涝。邢台属于温带大陆性季风气候，适宜酸枣的生长。山东与邢台的地理位置接近，因此黄酮的提取率相近。东南亚终年高温多雨，不适宜酸枣生长，所以提取率不太高。

3 结论

本实验以咪唑类离子液体1-己基-3-甲基-咪唑溴化盐（[Hmim]Br）的乙醇溶液为提取剂，采用超声波辅助提取，利用高效液相色谱法测定脱脂酸枣仁中的黄酮。结合单因素变化法探索出最优的实验条件：提取剂为 [Hmim]Br、提取剂浓度为V[Hmim]Br∶V乙醇=1∶6、超声时间为30min、固液比1∶50。该方法操作简单易行、适用性广，耗能小且提取率高，对环境无害，为酸枣仁中黄酮的提取研究提供参考。

[1]国家药典委员会.中国人民共和国药典.(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010.343-344.

[2]曾路,张如意,王序.酸枣仁化学成分研究[J].药学学报, 1987,22（2）:114.

[3]袁冒鲁,王中博,焦莹,等.酸枣仁中黄酮类镇静催眠有效成分的研究[J].中药通报,1987,9(12):34-36.

[4]赵兵,王玉春,欧阳潘,等,超声波在植物提取中的应用[J].中草药,1999,30(9):附1-附3.

[5]毛泽星,潘一,杨双春.离子液体的应用研究进展[J].当代化工,2013,42(2):196-198.

[6]陈君,周光明,杨远高,等.离子液体超声辅助提取高效液相色谱测定桑叶中黄酮 [D].西南大学化学化工学院, 2012.215-217.

[7]郭文希,高鹏,等.室温离子液体的理化性能[J].辽宁化工, 2003,32(6):256-259.

[8]伏劲松,王博,蔡光华.香柏总黄酮的提取工艺优化[J].食品科学,2011,32(2):5-8.

[9]许瑞波,曹晓英,王明艳,等.睡莲中黄酮的提取及其抑菌活性研究[J].食品科技,2009,(4):190-197.

[10]杨潇,代娟,芮光伟,等.知母中芒果苷的超声提取工艺研究[J].食品科技,2008,34(3):207-210.

[11]林海禄,彭雪娇,罗明,等.八角茴香中莽酸超声提取工艺研究[J].食品科技,2007,(4):76-78.

[12]向鸣,王晓君,王维香.超声波提取川芎多糖的工艺优选[J].中成药,2008,30(11):1621-1623.