牦牛血粉酶法制备氯化血红素工艺研究

文 / 李得信，师希雄，文鹏程，张炎，汪月，张忠明，张卫兵

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州，730070）

牦牛血粉酶法制备氯化血红素工艺研究

文 / 李得信，师希雄，文鹏程，张炎，汪月，张忠明，张卫兵

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州，730070）

为研究牦牛血资源的合理开发利用，试验以牦牛血粉为原料，采用酶法制备氯化血红素。研究了酶解温度、pH、时间、酶添加量等因素对氯化血红素制备的影响。试验表明，酶法制备氯化血红素的最佳工艺参数为：酶解温度55℃、酶解pH8.0、酶解时间5h、酶添加量为0.6%。此条件下氯化血红素的得率达到15.203mg/g。

牦牛血粉；氯化血红素；酶法

氯化血红素是吸收率最高的生物态铁剂，已经成为比较理想的抗贫血药，并且其药理已被临床证实。同时，氯化血红素在医药行业中已被广泛应用于血卟啉及其衍生物的制备[1-3]。从动物血液中制备得到的血红素产品一般为氯化高铁血红素(即氯化血红素Hemin)[4-5]。我国牦牛数量多，牦牛血资源丰富。牦牛血中的血红蛋白含量高，从中提取制备氯化血红素，原料独特丰富，成本较低，能够产生巨大的经济效益和社会效益[6-8]。当前，氯化血红素的制备方法很多为有机溶剂提取，而这些方法多数存在毒性大、成本高、工艺烦琐复杂、安全性低等缺点。用酶法制备氯化血红素，利用酶对蛋白的水解能力，从而将氯化血红素从中释放出来，具有生产成本低和生产方法简单、环保的特点[9]。

本试验以牦牛血粉为原料，对氯化血红素的粗提取工艺进行初步探索与研究，旨在探索出一种以牦牛血粉为原料提取制备氯化血红素的技术方法，从而为氯化血红素的低成本企业化生产提供理论基础。

1、材料与试剂

1.1 试验材料及试剂

牦牛血粉：兰州天和生物催化技术有限公司提供；氯化血红素标准品：Sigma公司；氢氧化钠：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；盐酸：分析纯，白银良友化学试剂有限公司；碱性蛋白酶：上海源叶生物科技有限公司

1.2试验仪器

紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；PHS-3C型数显酸度计 上海精密科学仪器有限公司；AL204电子分析天平梅特勒-托利多仪器有限公司；MR 3001磁力搅拌器 Heidolph；HWS26型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司

2、试验方法

2.1氯化血红素制备工艺流程

牦牛血粉 → 加酶 →调节pH→ 水解5小时 →煮沸灭酶→调pH至3.5 → 离心→氯化血红素

2.2不同酶解温度对氯化血红素得率的影响

加入2.0g血粉/100mL水，0.4%加酶量(即0.4%酶底比)，分别选取温度为45、50、55、60、65℃，调节溶液pH7.5，5h水解，95℃煮沸灭酶15min后，调溶液pH到3.5，在4000r/min条件下离心15min，测定吸光度值并计算得率。

2.3.不同酶解pH对氯化血红素得率的影响

加入2.0g血粉/100mL水，0.4%加酶量，酶解温度55℃，分别选取pH6.5、7、7.5、8、8.5调节溶液，5h水解，95℃煮沸灭酶15min，调溶液pH到3.5，在4000r/min条件下离心15min，测定吸光度值并计算得率。

2.4不同酶解时间对氯化血红素得率的影响

加入2.0g血粉/100mL水，0.4%加酶量，酶解温度55℃，调节溶液pH7.5，分别选取2h、3h、4h、5h、6h进行酶水解反应，95℃煮沸灭酶15min，调溶液pH到3.5，在4000r/min条件下离心15min，测定吸光度值并计算得率。

2.5 不同酶添加量对氯化血红素得率的影响

加入2.0g血粉/100mL水，分别选取0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的酶添加量，酶解温度55℃，调节溶液pH7.5，5h进行酶水解，95℃煮沸灭酶15min，调溶液pH到3.5，在4000r/min条件下离心15min，测定吸光度值并计算得率。

2.6正交试验设计

在单因素试验的基础上，酶解温度、酶解pH、酶解时间和酶液添加量4个因素各取3个水平，采用正交表进行正交试验，以进一步优化以牦牛血粉为原料酶法制备氯化血红素的工艺参数。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

2.6样品中氯化血红素的测定

取经过105℃干燥至恒重的氯化血红素样品，研成粉末；精密称取适量样品，置于100mL烧杯中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解，将溶液转移到100mL容量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液至刻度，摇匀，过滤。取滤液10mL于100ml容量瓶中，用0.1mol/L氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，以0.1mol/L的氢氧化钠溶液为空白，在390±1nm处测定样品的吸光度。根据血红素标准曲线计算得到样品中氯化血红素的质量，计算样品中血红素的纯度和得率[10-13]。

3、结果与分析

3.1不同酶解温度对氯化血红素得率的影响

酶解温度对氯化血红素得率的影响如图1所示。

图1 酶解温度对氯化血红素得率的影响。

由图1可以得出，温度对酶水解的影响很大，氯化血红素的得率总体呈现先升高后下降的趋势。在温度为45℃-50℃范围内，氯化血红素得率增幅较大，当温度升高到60℃时达到最高。当处理温度达到55℃时，氯化血红素的得率达到14.937mg/g。当处理温度到60℃时，氯化血红素得率升高不显著，为15.101mg/g，温度为65℃时，得率下降。由于生产中要节约成本，应该选择的酶解温度为55℃。

3.2不同酶解pH对氯化血红素得率的影响

不同酶解pH对氯化血红素得率的影响，结果如图2所示。

图2 酶解pH对氯化血红素得率的影响。

由图2可以得出，当酶解pH在7-8的范围内，酶解效果较好，氯化血红素得率都在13mg/g以上，其中当pH为7.5时，氯化血红素的得率最高，达到15.037mg/g。当酶解pH高于8时，由于碱性蛋白酶的活性受到抑制，氯化血红素未能完全释放出来，得率明显下降。因此取酶解pH为7-8较为适宜。

图3 酶解时间及酶的添加量对氯化血红得率的影响。

3.3不同酶水解时间对氯化血红素得率的影响

由图3可以得到，随着酶解时间的延长，更多的血红蛋白被分解为多肽和血红素，使产物的纯度升高，氯化血红素的得率也逐渐增加，当到5h时，得率达到14.978mg/g，超过5h后，得率增加缓慢，只有0.1左右的增加幅度，由于生产中要尽量缩短生产周期，所以选用的酶解时间为5h。随着时间的延长，碱性蛋白酶会将更多的血红蛋白分解成多肽溶解到溶液中，从而血红蛋白的含量会减少，总质量降低，纯度降低。

3.4不同酶添加量对氯化血红素得率的影响

酶添加量对氯化血红素得率的影响如图4所示。

图4 酶的添加量对氯化血红得率的影响。

由图4可以得出，随着酶添加量的增加，氯化血红素得率呈逐渐上升趋势，当酶添加量为0.6%时，氯化血红素的率达到最高14.773mg/g，超过0.6%时，酶量使底物逐渐饱和，抑制了反应，降低了氯化血红素的得率。

3.5正交试验

正交试验结果和方差分析分别见表2和表3。

表2 正交试验结果

表2 正交试验方差分析表

由表2可以看出，四个因素对产量的影响作用由大到小依次为：酶解温度＞酶解pH＞酶解时间＞酶添加量。得到提取制备氯化血红素的最优参数组合为A1B2C2D2，即酶解温度55℃，酶解pH8.0，酶解时间5h，酶添加量为0.6%。由表3的方差分析结果可以看出，酶解温度和酶解pH对氯化血红素得率的影响非常显著(P<0.01)，酶解时间对氯化血红素得率的影响较显著(P=0.013)，而酶的添加量对氯化血红素得率的影响不显著。

4、结论

结果表明，以牦牛血粉为原料酶法制备氯化血红素的最佳工艺参数为酶解温度55℃、酶解pH8.0、酶解时间5h、酶添加量为0.6%。在最优组合的时，氯化血红素的得率达到15.203mg/g。

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兰州市科技局项目(2014-1-144) ；甘肃农业大学SRTP项目(20141030)