基质金属蛋白酶－9基因R279Q位点多态性与脑梗死初发及复发的相关性研究

喻明，李凤，聂本刚，蒋世杰，方登富，陈小容，何晓菲

·论著·

基质金属蛋白酶－9基因R279Q位点多态性与脑梗死初发及复发的相关性研究

喻明，李凤，聂本刚，蒋世杰，方登富，陈小容，何晓菲

目的探讨基质金属蛋白酶(MMP－9)基因R279Q位点多态性与脑梗死初发及复发的相关性。方法

脑梗死;基质金属蛋白酶9;多态性，单核苷酸;复发

脑梗死是指脑部血液供应障碍、脑组织缺血缺氧而导致的组织坏死及相应神经功能缺损，占全部卒中的60%～80%［1］，动脉粥样硬化是其最常见病因［2］。多数首发脑梗死患者经及时治疗能够进入到恢复期和后遗症期，但一旦复发则其症状重于初发时，且愈发难治，严重时可危及生命。在我国，脑梗死患者5年内平均复发率在40%以上，防止脑梗死复发是当前国内外研究的一个热点问题。

脑卒中与基因多态性的关系是近年生命科学研究的热点和重点，家族聚集性研究、双生子研究、家系复合分离分析及遗传模式分析等结果表明，脑卒中符合多基因遗传规律，是一种多基因遗传疾病。脑卒中具有较高的表型异质性和遗传异质性，尽管国内外已广泛开展了该病的分子遗传学研究，但得到公认的阳性结果不多，各项研究结论亦难以互相重复或验证［3］。已有研究证实，基质金属蛋白酶9(MMP－9)是缺血性脑血管病的独立危险因素［4］，其基因多态性与动脉粥样硬化、心脑血管疾病密切相关。目前国内外关于MMP－9基因多态性与脑卒中的相关性研究尚不多见，而关于MMP－9基因多态性与脑梗死初发及复发的相关性研究更是少之又少。本研究旨在探讨MMP－9基因R279Q位点多态性与脑梗死初发及复发的相关性，为脑梗死的防治提供参考。

1 对象与方法

1．1 研究对象选择2012年4月—2014年4月在遂宁市中心医院神经内科住院的初发脑梗死患者350例作为初发脑梗死组，复发脑梗死患者340例作为复发脑梗死组，同期在我院体检健康者360例作为对照组。病例纳入标准:初发脑梗死和复发脑梗死的诊断均符合全国第四届脑血管病学术会议制定的诊断标准［5］，年龄≥18岁，脑梗死发病3 d内入院，并经临床、颅脑CT和/或MRI检查确诊，行颈部血管彩超检查(部分患者行颅脑MRA检查)明确为TOAST分型中大动脉粥样硬化性脑梗死［6］;复发性脑梗死患者需同时满足以下条件:(1)出现新的神经功能缺损症状;(2)本次发病症状较初发症状重，距第1次梗死时间＞1个月，并排除进展性卒中;(3)影像学检查证实有新的缺血病灶。病例排除标准:(1)不合作者，患者或其家属不同意参加本研究或拒绝留取标本;(2)合并动脉炎及其他类型血管炎、脑动脉畸形及心源性脑栓塞;(3)合并严重呼吸系统感染或其他严重感染;(4)合并严重肝脏疾病和/或肝功能损害;(5)合并严重肾脏疾病和/或肾功能损害(血肌酐＞220 μmol/L);(6)合并严重贫血(血红蛋白＜80 g/L)或凝血功能障碍或其他严重血液系统疾病;(7)近期有创伤史、手术史、妊娠史、传染性疾病及寄生虫疾病史;(8)近6个月内服用过降脂药和/或雌激素、避孕药;(9)合并严重内分泌疾病、自身免疫性疾病和/或恶性肿瘤。3组受试者间均无血缘关系，入组前均签署知情同意书。

1．2 方法初发脑梗死组、复发脑梗死组患者于入院次日、体检组受试者于体检当日清晨空腹抽取肘静脉血，检测血糖、血脂、血清MMP－9水平等，血清MMP－9水平的检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)，试剂盒购自美国R＆D公司。MMP－9基因R279Q位点多态性检测采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(PCR－RFLP)分析法:(1)DNA提取:将抽取的肘静脉血置于抗凝管中，－80℃冰箱冻存，采用血液基因组提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司提供)抽提基因组DNA;(2)引物设计及合成:采用Primer 5．0软件(加拿大Premier公司提供)进行引物设计，引物合成由上海生物工程有限公司完成，MMP－9基因R279Q位点上游引物序列为5'－TCACCCTCCCGCACTCTGG－3'，下游引物序列为5'－CGGTCGTAGTTGGCGGTGG－3'，扩增片段长度为300 bp;(3)PCR反应体系:10×buffer 2 μl，dNTP(10 mmol/L)1 μl，上下游引物各1 μl，DNA模板0．1 μg，DNA聚合酶2 U，加ddH2O至20 μl，反应结束后经2%琼脂糖凝胶电泳分析，采用凝胶成像仪检测PCR产物特异性，PCR纯化试剂盒(德国Qiagen公司生产)纯化PCR产物;(4)酶切反应:反应体系包括PCR纯化产物1 μg，10×buffer 1 μl，MspⅠ内切酶1．5 U(New England Biolabs公司生产)，加ddH2O至10 μl，37℃酶切16 h，经2%琼脂糖凝胶电泳分析后，采用凝胶成像仪进行判定。

1．3 统计学方法采用SPSS 13．0软件包进行统计分析，样本群体代表性的检测釆用Hardy－Weinberg平衡法;计量资料以(x±s)表示并进行正态性检验，均符合正态分布，采用方差分析;计数资料釆用χ2检验;各因素与初发脑梗死、复发脑梗死的相关性采用多因素Logistic回归分析，以OR及其95%CI表示。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 MMP－9基因R279Q位点多态性PCR扩增产物经MspⅠ内切酶酶切后电泳结果显示，MMP－9基因R279Q位点AA基因型可见300 bp基因片段，GG基因型可见170、130 bp基因片段，AG基因型可见300、170、130 bp基因片段。Hardy－Weinberg平衡法结果显示，对照组、初发脑梗死组及复发脑梗死组受试者MMP－9基因R279Q位点多态性具有群体代表性(χ2值分别为1．613、1．398、1．957，P＞0．05)。3组受试者基因型及等位基因分布比较，差异均有统计学意义(P＜0．05);初发脑梗死组、复发脑梗死组MMP－9基因R279Q位点GG基因型频率及G等位基因频率高于对照组，复发脑梗死组高于初发脑梗死组，差异均有统计学意义(P＜0．05，见表1)。

表1 3组受试者MMP－9基因R279Q位点基因型及等位基因分布〔n(%)〕Table 1 Genotypes and allelic genes of MMP－9 R279Q among the three groups

2．2 单因素分析结果3组受试者性别、年龄、体质指数、糖尿病发生率、饮酒率、总胆固醇、三酰甘油、HDL－C、空腹血糖比较，差异均无统计学意义(P＞0．05);3组受试者高血压发生率、吸烟率、LDL－C、MMP－9比较，差异均有统计学意义(P＜0．05，见表2)。

2．3 多因素分析结果以初发脑梗死组、复发脑梗死组患者临床特征及MMP－9基因R279Q位点多态性为自变量，分别以脑梗死初发、脑梗死复发为因变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示血清MMP－9水平增高是脑梗死初发的独立危险因素〔OR=1．336，95% CI(1．031，1．072)，P=0．028〕，但不是脑梗死复发的独立危险因素〔OR=0．609，95%CI(0．428，1．006)，P＞0．05〕;MMP－9基因R279Q位点多态性是脑梗死初发〔OR=1．496，95%CI(1．028，2．159)，P= 0．007〕和脑梗死复发〔OR=1．625，95%CI(1．072，2．566)，P=0．005〕的独立危险因素。

表2 3组受试者临床资料比较Table 2 Comparison of clinical data among the three groups

3 讨论

脑梗死是一种多基因遗传疾病，但目前其确切发病机制及具体病理生理过程尚不完全清楚。随着人们生活水平提高及人口老龄化进程加剧，脑梗死发病率及复发率越来越高，因此，防止脑梗死发病及复发成为当前研究热点。动脉粥样硬化是脑梗死的最常见病因［2］，而MMP－9是基质金属蛋白酶家族的重要成员，其过度表达可通过介导血管中膜平滑肌细胞迁移、增殖、凋亡及细胞外基质降解而参与动脉粥样硬化的发生和发展［7］。此外，MMP－9过度表达还可大量降解动脉粥样硬化斑块中纤维成分，导致斑块破溃、脱落，最终导致脑梗死的发生［8］。多项研究表明，血浆MMP－9水平与斑块稳定性相关，参与了缺血性脑卒中的发生、复发及出血转化［9－10］。Alvarez等［11］研究认为，血清MMP－9水平与粥样斑块内巨噬细胞水平相关，缺血性脑血管疾病患者血清MMP－9水平高于正常对照者。Graham等［12］研究发现，血清MMP－9水平可作为判断动脉粥样硬化斑块性质及预测脑梗死发病的参考指标。本研究结果显示，初发脑梗死组、复发脑梗死组患者血清MMP－9水平均高于对照组，且复发脑梗死组高于初发脑梗死组，血清MMP－9水平升高是脑梗死初发的独立危险因素，提示MMP－9参与了脑梗死的发生，与之前文献报道结果一致。

人MMP－9基因定位于20q11．2～13．1，全长7．7 kb，共含有13个外显子和12个内含子，其调控作用主要发生在转录水平。目前已发现MMP－9基因存在多个序列变异，其中关于R279Q位点多态性的研究报道不多见。R279Q位点变异表现为MMP－9基因第6个外显子的A被G取代，使mRNA编码的谷氨酰胺变成了精氨酸，进而导致蛋白表达异常及血清MMP－9水平改变，继而参与脑梗死的发生和发展。Wägsäter等［13］研究证实，MMP－9基因R279Q位点多态性与动脉粥样硬化过程中的细胞外基质降解、血管中膜平滑肌细胞增殖、炎性细胞浸润、斑块破裂等病理过程有关，进而参与了脑卒中、冠心病及一些急性血管事件的发生。Blankenberg等［14］研究发现，MMP－9基因R279Q位点等位基因分布异常可导致血清MMP－9水平增高，与心血管事件复合终点及非致命性心肌梗死的发生相关。本研究结果显示，初发脑梗死组、复发脑梗死组MMP－9基因R279Q位点GG基因型频率及G等位基因频率高于对照组，复发脑梗死组高于初发脑梗死组，MMP－9基因R279Q位点多态性是脑梗死初发和脑梗死复发的独立危险因素，推测其可能作用机制为:MMP－9基因R279Q位点G等位基因频率增高导致基因转录活性增加，导致MMP－9表达上调，过度表达的MMP－9一方面通过降解血管壁细胞外基质而诱导巨噬细胞增殖、泡沫细胞形成及血管壁炎性反应，进而促进动脉粥样硬化斑块形成，另一方面还可破坏动脉粥样硬化斑块表面纤维帽而导致动脉粥样斑块破裂、血栓形成及机化，最终导致动脉粥样硬化程度加重及斑块扩大，诱发再次脑梗死，即复发。此外，脑梗死时血－脑脊液屏障被破坏、血管通透性增高也可导致MMP－9进入外周循环，继而导致血清MMP－9水平升高。

综上所述，MMP－9基因R279Q位点多态性是脑梗死初发和脑梗死复发的独立危险因素，MMP－9基因可能是一种潜在的脑梗死遗传易感基因。但本研究样本量有限，观察指标还不够完整、全面，关于MMP－9基因R279Q位点多态性与脑梗死初发及复发的相关性还有待进一步开展多中心、大样本、前瞻性研究进行深入探讨。

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ObjectiveTo investigate the correlation between matrix metalloproteinase－9(MMP－9)gene R279Q polymorphism and first onset and recurrence of cerebral infarction．MethodsFrom April 2012 to April 2014 in the Department of Neurology，Suining Central Hospital，350 first onset cerebral infarction patients were selected as A group，340 recurrent cerebral infarction patients were selected as B group，and 360 healthy cases were seled as control group．Polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism(PCR－RFLP)method was used to analyze the MMP－9 gene R279Q polymorphism，enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect the serum MMP－9 level．ResultsGG genotype frequency and G allele frequency of groups A and B were higher than those of control group，respectively(P＜0．05)，and those of A group were higher than those of B group(P＜0．05)．No significant differences of gender，age，BMI，incidence of diabetes，drinking rate，TC，TG，HDL－C，fasting blood glucose among the three groups(P＞0．05);while there was significant differences of incidence of hypertension，smoking rate，LDL－C，MMP－9 among the three groups(P＜0．05)．Multiple Logistic regression analysis showed that，higher serum MMP－9 level was an independent risk factor of first onset of cerebral infarction〔OR=1．336，95%CI(1．031，1．072)，P=0．028〕，but was not of recurrence of cerebral infarction〔OR=0．609，95%CI(0．428，1．006)，P＞0．05〕;MMP－9 gene R279Q polymorphism was an independent risk factor of first onset of cerebral infarction〔OR=1．496，95%CI(1．028，2．159)，P=0．007〕and recurrence of cerebral infarction〔OR=1．625，95%CI(1．072，2．566)，P=0．005〕，respectively．ConclusionMMP－9 gene R279Q polymorphism is an independent risk factor of first onset and recurrence of cerebral infarction，MMP－9 gene may be a potential genetic susceptibility gene of cerebral infarction．

Brain infarction;Matrix metalloproteinase 9;Polymorphism，single nucleotide;Recurrence

R 743．33

A

10．3969/j．issn．1008－5971．2015．01．012

2014－10－15;

2014－12－25)

(本文编辑:鹿飞飞)

四川省遂宁市科学与知识产权局项目(2014015)

629000四川省遂宁市中心医院神经内科

选择2012年4月—2014年4月在遂宁市中心医院神经内科住院的初发脑梗死患者350例作为初发脑梗死组，复发脑梗死患者340例作为复发脑梗死组，同期在我院体检健康者360例作为对照组，采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(PCR－RFLP)分析法检测MMP－9基因R279Q位点多态性，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清MMP－9水平。结果初发脑梗死组、复发脑梗死组MMP－9基因R279Q位点GG基因型频率及G等位基因频率高于对照组，复发脑梗死组高于初发脑梗死组(P＜0．05)。3组受试者性别、年龄、体质指数、糖尿病发生率、饮酒率、总胆固醇、三酰甘油、HDL－C、空腹血糖比较，差异均无统计学意义(P＞0．05);3组受试者高血压发生率、吸烟率、LDL－C、MMP－9比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)。多因素Logistic回归分析结果显示，血清MMP－9水平增高是脑梗死初发的独立危险因素〔OR=1．336，95%CI(1．031，1．072)，P=0．028〕，但不是脑梗死复发的独立危险因素〔OR= 0．609，95%CI(0．428，1．006)，P＞0．05〕;MMP－9基因R279Q位点多态性是脑梗死初发〔OR=1．496，95%CI (1．028，2．159)，P=0．007〕和脑梗死复发〔OR=1．625，95%CI(1．072，2．566)，P=0．005〕的独立危险因素。结论MMP－9基因R279Q位点多态性是脑梗死初发和脑梗死复发的独立危险因素，MMP－9基因可能是一种潜在的脑梗死遗传易感基因。

喻明，李凤，聂本刚，等．基质金属蛋白酶－9基因R279Q位点多态性与脑梗死初发及复发的相关性研究［J］．实用心脑肺血管病杂志，2015，23(1):37－40．［www．syxnf．net］

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Correlation between Matrix Metalloproteinase－9 Gene R279Q Polymorphism and First Onset and Recurrence of Cerebral InfarctionYU Ming，LI Feng，NIE Ben－gang，et al．Department of Neurology，Suining Central Hospital，Suining 629000，China