贵州瑶山鸡线粒体DNA D-loop区序列的多态性

韩 雪， 吴松成， 朱丽莉， 陶宇航

(贵州省畜牧兽医研究所， 贵州 贵阳 550005)



贵州瑶山鸡线粒体DNA D-loop区序列的多态性

韩 雪， 吴松成， 朱丽莉， 陶宇航

(贵州省畜牧兽医研究所， 贵州 贵阳 550005)

为从母系遗传角度探明贵州瑶山鸡的群体遗传背景，采用PCR产物直接测序技术对124只贵州瑶山鸡样品的线粒体DNA控制区(mtDNA D-loop)第Ⅰ高变区序列进行分析。结果表明：所分析的D-loop区部分序列(570 bp)中，A、G、C、T核苷酸平均含量分别为30.1%、13.5%、29.5%和26.9%；有26个核苷酸多态位点，其中转换位点24个，颠换位点1个，转换和颠换同时存在位点1个；核苷酸多样度(Pi)平均为0.013 5；核苷酸平均差异数(k)为6.457；单倍型21种，多样度(Hd)平均为0.793。通过群体构建的NJ聚类图分子系统树发现，贵州瑶山鸡起源于红原鸡。

贵州瑶山鸡； 线粒体DNA D-loop； 遗传多样性； 单倍型

线粒体DNA(mtDNA)呈共价闭合的环状分子，序列长度约16 kbp，其中，D-Loop区属于高度变异的非编码区，可分为高变Ⅰ区(1～316 bp)、中间保守Ⅱ区(317～784 bp)和保守序列Ⅲ区(785～1 157 bp)[1]。由于mtDNA具有结构简单、严格母系遗传、进化速率快等特点，线粒体是细胞中重要的核外遗传信息载体，遵循严格的母性遗传方式。其已成为近年来研究动物遗传进化的最佳手段之一。

贵州瑶山鸡主产于荔波县西南部的瑶山瑶族乡，是经过瑶族群众独特的养殖习俗和管理方式逐步形成的优良地方品种，是宝贵的地方鸡资源。其体型紧凑，具有生长快、饲料转化率高、抗逆性强、耐粗放、适应性强等优点，有很好的经济价值和开发利用价值。廖正录等[2]对贵州瑶山鸡品种资源进行了调查，安军等[3]介绍了贵州瑶山鸡育雏期的饲养管理及林下散养技术，唐继高等[4]测定了贵州瑶山鸡的肌肉常规成分与氨基酸含量，朱丽莉等[5]对贵州瑶山鸡的生产性能进行了研究。但到目前为止未见对其种质遗传特性的研究报道。为此，笔者采用mtDNA D-Loop区进行遗传结构分析，为从母系遗传角度探明贵州瑶山鸡的群体遗传背景。

1 材料与方法

1.1 贵州瑶山鸡及DNA提取

供试贵州瑶山鸡124只，随机选自贵州省荔波县瑶族乡贵州瑶山鸡养殖场，每只鸡翅静脉采血3 mL，EDTA抗凝，-20℃保存备用。采用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA。

1.2 PCR扩增及测序

引物序列为L16750：5′-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3′，H547：5′-ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG-3′[6]。

PCR扩增反应体系：DNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Taq PCR Mastermix(北京天根生化科技有限公司)7 μL，最后加ddH2O至20 μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物回收与测序由北京鼎国生物技术有限公司完成。

1.3 数据分析

所测DNA序列用DNASTAR 5.0软件包进行拼接，用ClustalX 1.83进行多重比对[7]，然后用DnaSP 5.10软件分析序列多态性[8]。从GenBank获得红原鸡(NC-001323)、绿色原鸡(NC-007238)、灰原鸡(NC-007240)、锡兰原鸡(NC-0072389)以及红原鸡3个亚种爪哇红原鸡(NC-007236)、锡兰红原鸡(NV-007235)、交趾鸡(NC-007237)等mtDNAD-loop区序列，利用软件MEGA 4.0[9]构建贵州瑶山鸡NJ系统树，同时构建MP树和UPGMA树。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物检测

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶检测，所得条带与目的片段大小一致(图1)，且无杂带，表明引物特异性较高。

注：M为2 000 bpMarker，1为空白对照，2～10为不同的样品的PCR扩增条带。

Note：M, 2000bp marker; 1, CK; 2～10, PCR amplification of different samples.

图1 PCR扩增电泳图谱

Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification

2.2 碱基组成

贵州瑶山鸡mtDNA D-Loop核苷酸序列中A、C、G、T核苷酸的平均比例分别为30.1%、13.5%、29.5%和26.9%。A+T含量为57%，G+C含量为43%，说明贵州瑶山鸡线粒体DNA D-loop区部分序列富含A+T；表现出碱基组成的偏倚性。

2.3 遗传多态性

贵州瑶山鸡mtDNA D-loop区部分序列大小为570 bp，包括高变Ⅰ区和部分保守Ⅱ区。以其中任一单倍型h1作为标准进行比较分析，确定21种单倍型(表)，其中h12单倍型个体数最多。共有26个变异位点，约占分析位点总数的4.56%，其中单一多态位点5个，分别在98 bp、138 bp、167 bp、229 bp和235 bp处；简约信息位点21个，分别在91 bp、170 bp、174 bp、195 bp、215 bp、222 bp、227 bp、241 bp、256 bp、276 bp、281 bp、291 bp、294 bp、295 bp、298 bp、312 bp、320 bp、325 bp、330 bp、338 bp和370 bp处。

26个变异位点碱基发生转换的有24个，占92.3%；发生颠换的有1个，占3.85%；转换和颠换同时存在的有1个，占3.85%。核苷酸多样度(Pi)平均为0.0135，核苷酸平均差异数(k)为6.457，单倍型多样度(Hd)平均为0.793。

2.4 系统树

NJ系统树、MP树和UPGMA树的拓扑结构一致。从图2看出，贵州瑶山鸡21种单倍型的系统发生数聚为3个分支。红原鸡(NC-001323)、锡兰红原鸡(NV-007235)、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、h17和h18聚为第1个分支；爪哇红原鸡(NC-007236)、交趾鸡(NC-007237)、h3、h4、h5、h12、h19、h20、h21聚为第2个分支；h6和h7聚为第3个分支。

表 贵州瑶山鸡种群体mtDNA D-loop区 单倍型及其变异位点

Table Haplotypes and their variation loci of mt DNA D-loop region in Guizhou Yaoshan Chicken population

单倍型Haplotypes变异位点Variationloci数量/只Quantity比例%Proportion[111112222222222222333333][99367791222345789999122337][18870455279516611458205080]h1AGCAAGTAGAGGGTAGGGCTGGCTGA129.677419h2.................C........10.806452h3........................A.1814.516130h4..............G.........A.10.806452h5..............G.......T.A.10.806452h6.......GA..AT........AT.A.10.806452h7.......GA...T........AT.A.10.806452h8G........G....GA.A..AA..AG64.838710h9G........G....GA.A.CAA..AG43.225806h10G........G....GA.A..AA.CAG10.806452h11G........G....GA.A..AA..A.10.806452h12G.......AG....GAAA...AT.A.4838.709680h13G.......AGA...GAAA...AT.A.10.806452h14G.T.....AG....GAAA...AT.A.10.806452h15G..G....AG....GAAA...AT.A.10.806452h16G.......AG....GAAA.C.AT.A.10.806452h17G.......AG....GAAA...ATCA.10.806452h18G.............GA.A...AT.A.10.806452h19G...GAC......CG...T..A..A.2116.935480h20GA..GAC......CG...T..A..A.10.806452h21G.............G......A..A.10.806452

图2 贵州瑶山鸡mtDNA D-loop区 序列单倍型的NJ系统树

Fig.2 NJ phylogenetic tree of mtDNA D-loop region in Guizhou Yaoshan Chicken

3 结论与讨论

傅衍等[6]在仙居鸡、灵昆鸡、来航鸡、白银耳鸡、萧山鸡、白羽乌骨鸡的D-loop第一高变区相同序列只检测到24个变异位点，序列变异率为4.45%，单倍型数为13种。蒋利等[10]在泸宁鸡、米易鸡、草科鸡的D-loop区相同序列中只检测到30个变异位点，序列变异率为5.09%，单倍型数为19种。试验结果表明，贵州瑶山鸡mtDNA D-loop区部分序列全长为570 bp，有26个突变位点，约占核苷酸总数的4.56%，有21种单倍型数。对于核酸序列来说，核苷酸多样度是衡量群体遗传变异程度的重要指标，核苷酸多样度越大，群体遗传变异程度越高[11]。贵州瑶山鸡的平均核苷酸多样度为0.013 5，与傅衍等[6]和蒋利等[10]的研究相比，平均核苷酸多样度核处于较高位置，说明该群体的遗传变异程度较高，遗传多样性较为丰富。一般认为，分歧时间越长、亲缘关系越远的分类单元之间，核苷酸发生颠换的频率越高。贵州瑶山鸡mtDNA D-loop区部分序列中核苷酸出现转换24个、颠换1个，转换和颠换在同一位点1个，转换出现的频率明显高于颠换，表明贵州瑶山鸡群体内出现的分歧时间并不长，亲缘关系比较近，与实际情况相符。

贵州瑶山鸡所有单倍型个体与红原鸡及红原鸡的3个亚型聚在一个大分支上，表明贵州瑶山鸡起源于红原鸡，并有多个母系起源。

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(责任编辑： 冯 卫)

Polymorphism of mtDNA D-loop Region in Guizhou Yaoshan Chicken

HAN Xue, WU Songcheng, ZHU Lili, TAO Yuhang

(GuizhouInstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,Guiyang,Guizhou550005,China)

The sequence of mtDNA D-loop I hypervariable region of 124 Guizhou Yaoshan Chicken was analyzed by using PCR product sequencing to explore the population genetic background of Guizhou Yaoshan Chicken from the angle of matrilineal inheritance. Results:The average content of A, G, C and T nucleotides in partial sequence (570 bp) of the analyzed D-loop region is 30.1%, 13.5%, 29.5% and 26.9% respectively.There are 26 nucleotide polymorphic loci including 24 transition loci, 1 transvertion locus and 1 locus with transition and transvertion. Average nucleotide diversity (Pi) is 0.013 5. Average nucleotide difference (k) is 6.457. 21 haplotypes are identified and the average diversity (Hd) is 0.793. Guizhou Yaoshan Chicken is originated from Red Jungle Fowl.

Guizhou Yaoshan Chicken; mitDNA D-Loop region; genetic diversity; haplotype

2014-12-28； 2015-06-17修回

贵州省农业科学院基金项目“贵州瑶山鸡的纯繁选育研究”[黔农科(基金)2011007]；贵阳市科技局项目“省级农业科技示范园区——贵州瑶山鸡高产种群纯繁技术研究与示范推广”[筑科合同(2013102)1-2-1]

韩 雪(1982-)，女，助理研究员，硕士，从事动物遗传育种工作。E-mail：hanxue8855601@126.com

1001-3601(2015)07-0352-0023-03

S831.2

A