浓香型大曲中1株高液化力功能细菌的筛选与鉴定

陈晓旭， 明红梅*， 罗惠波， 许德富， 朱莉莉， 姚 霞， 薛登文

(1.四川理工学院 生物工程学院， 四川 自贡 643000； 2.泸州老窖股份有限公司， 四川 泸州 646000)



浓香型大曲中1株高液化力功能细菌的筛选与鉴定

陈晓旭1， 明红梅1*， 罗惠波1， 许德富2， 朱莉莉1， 姚 霞1， 薛登文1

(1.四川理工学院 生物工程学院， 四川 自贡 643000； 2.泸州老窖股份有限公司， 四川 泸州 646000)

为探寻大曲微生物与风味物质之间的相关性，为构建大曲功能菌群及实现制曲生产异地化奠定基础，采用平板筛选、固态发酵、16S rDNA鉴定及HS-SPME-GC-MS等方法对浓香型大曲中的高液化力菌株进行筛选与鉴定。结果表明：菌株X20与枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列同源性高达99%，可确定其为枯草芽孢杆菌；该菌株的液化力高达11.756 g/(g·h)，其代谢产物含有吡嗪类物质、愈创木酚和苯甲醛等多种重要的大曲风味物质，可初步确定其为大曲的功能菌株。

浓香型大曲； 高液化力； 细菌； 功能菌株； HS-SPME-GC-MS； 16S rDNA

浓香型白酒具有窖香浓郁、绵甜爽洌、香味协调、尾净味长等特点[1]而广受大众喜爱。曲为酒之骨，有好酒必有好曲。大曲中的微生物大体可分为细菌、霉菌和酵母菌三大类[2]，其在曲块上生长、繁殖、代谢产生各种酶系，使大曲具有液化、糖化和蛋白质分解等能力，该功能特性指标也是大曲培养和产品质量的关键所在[3]。

大曲中的细菌具有水解淀粉和蛋白质的能力，有的细菌能代谢产生酒中的芳香成分前体物质乙偶姻、二乙酰等[4]。杨帆等[5]对茅台大曲中芽孢杆菌的代谢产物进行比对分析发现，其代谢产物中含有大曲重要的风味物质且浓度较高。大曲淀粉水解酶中液化酶是影响白酒产量和质量的重要因素[6]，细菌的液化力是指大曲中多种酶对淀粉水解的综合能力，主要是α-淀粉酶的作用。α-淀粉酶能首先将淀粉分解为糊精、少量麦芽糖等，然后其他淀粉酶进一步将其水解，促进大曲的糖化[7]，进而形成大曲中众多的风味成分。

目前，浓香型大曲微生物的研究主要集中在优良菌种的筛选、鉴定和应用于强化大曲[8-10]等方面，而对于大曲微生物与风味物质之间相关性研究较少。为此，笔者采用平板透明圈初筛和固态发酵产物的产酶分析，结合检测挥发性代谢产物等方法，对中高温浓香型大曲中的细菌进行筛选，初步探寻大曲微生物与风味物质之间的联系，以期筛选出高液化力的制曲功能菌株，构建大曲的功能菌群，使大曲的生产发酵过程简单化，为制曲生产异地化再现提供条件。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 大曲 由泸州老窖制曲生态园提供。

1.1.2 仪器与设备 RT-34型静音研磨粉碎机，北京环亚天元机械技术有限公司；MJ-250型恒温培养箱，上海和羽电子科技有限公司；TW-200W型可控调温电炉，天津市泰斯特仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS 固相微萃取头，美国Supelco 公司；手动SPME进样器，美国Supelco公司；Agligent 6890N-5975B气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；毛细管色谱柱为DB-WAX，规格为(60 m×250 μm×0.25 μm)。

1.1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、琼脂17.5 g/L，pH 7.4～7.6，121℃灭菌30 min。α-淀粉酶筛选培养基：牛肉膏5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，可溶性淀粉20 g/L，琼脂17.5 g/L，121℃灭菌30 min。小麦固体培养基：每80 g小麦粉分装于250 mL锥形瓶，调节小麦原料含水36%左右， 121℃灭菌20 min。

1.2 浓香型大曲高液化力细菌的筛选

无菌条件下取约15 g大曲样品放入研钵中，待样品充分分散后无菌称取10 g样品放入装有90 mL无菌水的灭菌三角瓶，置于摇床(37℃，200 r/min)震荡30 min，然后逐步稀释至10―7。选取10―5、10―6和10―73个稀释度，各吸取150 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，每个稀释度做3个平行，将涂布后的平板倒置于37℃下培养24 h，挑取培养基上不同形态的菌落进一步纯化培养，直至形成单菌落的细菌菌株再接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基培养，然后于4℃保存备用。

1.3 浓香型大曲高液化力细菌的平板初筛

将斜面保藏的细菌菌株活化后点接到α-淀粉酶筛选培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12 h。取出后滴碘液于培养好的平板上，使碘液覆盖整个平板，待显色后观察水解透明圈的大小并用游标卡尺测量透明圈直径(H)和菌落直径(C)，计算两者比值(H/C)，通过比值的大小初步筛选出能产α-淀粉酶的菌株。比值越大，说明该菌株产α-淀粉酶的能力较强。

1.4 高液化力细菌的固态发酵

无菌操作条件下，用移液枪将产α-淀粉酶优良菌株的种子培养液以10%的接种量接种到装有80 g小麦固体培养基的三角瓶中并拌匀，用八层纱布封口，将接种好的小麦培养基于37℃恒温培养箱中静置培养96 h，中间间歇手工震荡，发酵结束后检测所接优良菌株(X20，X8，X2，X19，X11)的液化力指标。

1.5 细菌液化力的测定

1) 称取相当于10.0 g绝干的细菌固态发酵试样，加20 mL pH4.6的醋酸钠缓冲溶液，用水调至总体积200 mL，充分搅拌。将装有试样的烧杯置于35℃恒温水浴锅中保温浸渍1 h，过滤取滤液，制得5%试样酶液备用。

2) 吸取20 mL淀粉溶液(20 g/L)于150 mL锥形瓶中，加入5 mL pH4.6的醋酸钠缓冲溶液摇匀，于水浴中预热至试液为35℃时，加入10 mL 5%试样酶液充分摇匀并立即记时，用胶头滴管吸取反应液2～3滴滴入预先滴有1滴碘液的白瓷盘中进行呈色反应，直至试液不变色(碘液本色)为终点，记下反应时间[11]。

1.6 HS-SPME-GC-MS法测定细菌固态发酵产物的挥发性物质

将固相微萃取装置的萃取头在气相色谱的进样口老化，温度为250℃，时间为15 min。称取5 g发酵产物于15 mL装样瓶中，在60℃条件下平衡15 min。将固相微萃取器的萃取头插入装样瓶，吸附30 min后缩回纤维头，再插入GC-MS中检测发酵产物的挥发性物质。

GC-MS操作条件：最高温度230℃，程序升温；进样量1 μL，进样方式为手动不分流，进样口温度为230℃；质谱电离源EI；采集方式为全扫描；容积延迟3 min；离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃；增益系数1。

1.7 细菌菌株分子生物学(16S rDNA)鉴定

引物：27F∶5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；1492R∶5’-TACGGYTACCTTGTTACG-3’，由上海英潍捷基合成。PCR反应体系(50 μL)：10×buffer 5 μL，dNTPs 4 μL， Mg2+3 μL，引物2 μL，Taq酶1 μL，ddH2O 34 μL，模板1 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环30次。4℃保存。

基因测序由上海杰李公司完成，采用DNAstar将测序结果进行序列拼接和去除多余碱基后，登陆NCBI进行BLAST分析，采用MEGA6进行发育树构建，重复取样1 000次进行bootstrap。

2 结果与分析

2.1 浓香型大曲中高液化力细菌的初筛

菌株X11、X20碘液显色结果如图1所示，菌株X11周围的透明圈较小，菌株X20周围的透明圈明显较大。从表可见，筛选出的20株细菌中菌株X20、X8、X2、X19和X11的H/C较大，说明该5株细菌的液化能力较强。其中，菌株X20的H/C最大，为1.76；X11的H/C最小，为1.34；5株细菌H/C比值的排序为X20>X2>X8>X19>X11。平板比值可初步体现菌株液化力高低，液化力大小还需通过进一步测定。

图 1 液化力细菌的碘液显色反应

Fig.1 Chromogenic reaction of bacteria liquefying power

表 液化力细菌的平板初筛

Table Results of liquefying power preliminary screening

菌种号StrainNo.水解透明圈直径/mmH菌落直径/mmC透明圈与菌落直径比H/CX2017.29.81.76X815.010.01.50X29.46.11.54X1911.28.11.38X1111.58.61.34

2.2 细菌液化力的测定

选取初筛结果中H/C比值较大的X20、X8、X2、X19和X11细菌菌株进行固态发酵，并对其发酵产物的液化力进行定量测定(重复5次测定值)的结果表明，菌株的液化力依次为X20>X19>X2>X8>X11。其中，菌株X20的液化力最高，为(11.756±0.15)g/(g·h)；其次是菌株X19，其液化力为(0.817±0.10)g/(g·h)；菌株X2、X8和X11的液化力分别为(0.496±0.47)g/(g·h)、(0.468±0.23)g/(g·h)和(0.407±0.36)g/(g·h)。由方差分析可知，菌株X20、X8、X2、X19和X11的液化力之间差异均显著，固态发酵结果与液化力细菌的平板初筛结果基本一致，其液化力均高于传统大曲质量指标认定的质量上乘标准[≥0.5 g/(g· h)][12]。因此，选取液化力最高的菌株X20进行后续试验。

2.3 菌株X20发酵产物的GS-MS分析

从图2可见，菌株X20的发酵产物中共检测到挥发性风味物质14种，主要包括吡嗪类、酚类、醇类和醛类等。吡嗪类物质一般都具有烘焙和坚果香[13]，醇类、醛类均会产生使人愉快的气味，有些醛、醇本身还具有花草和水果的香气，这些风味成分对浓香型大曲复合曲香的形成有一定的贡献[14]。发酵产物中检测到的2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、愈创木酚和苯甲醛等均属于大曲中的重要风味物质[15-16]，吡嗪类物质、愈创木酚、苯甲醛的形成与淀粉水解及蛋白质水解作用相关[17]。菌株X20的高液化力特性有助于淀粉水解和糖化，糖和氨基酸等物质经过一系列复杂的生物化学变化，产生大曲中重要的风味物质。因此，可初步确定菌株X20为大曲的功能菌株。

注：7为2, 5-二甲基吡嗪；11为 2,3,5-三甲基吡嗪；15为 2,3,5,6-四甲基吡嗪；18为苯甲醛；22为2,3-丁二醇；30为萘；31为愈创木酚；33为 4-乙基愈创木酚；34为对乙烯基愈创木酚。

Note: 7, 2,5-dimethylpyrazine;11, 2,3,5-trimethylpyrazine; 15, 2,3,5,6-tetramethylpyrazine; 18, benzaldehyde; 22, 2,3-butanediol; 30, naphthalene; 31, guaiacol; 33, 4-ethylguaiacol; 34, vinyl guaiacol.

图2 菌株X20挥发性化合物的总离子流

Fig.2 Total ion chromatograms for the volatile compounds in X20 strain

2.4 菌株X20的菌落形态及其16S rDNA的鉴定

2.4.1 菌株X20的菌落形态 从图3可见，菌株X20在牛肉膏蛋白胨培养基上培养12 h后形成乳白色、不规则圆形、不透明、湿润并有光泽的菌落，菌落边缘较中间厚，不产色素。同时，菌株X20经革兰氏染色显阳性，在显微镜下观察，细胞呈杆状。

注： a,菌株X20的菌落形态;b,菌株X20的细胞革兰氏染色。

Note: a,colony morphology of X20;b,cell gram stain of X20.

图3 菌株X20的细胞形态及其菌落形态特征

Fig.3 Gram dyeing and colony morphology of X20

注：M为0.1～2 Kb分子质量Marker；1为16S rDNA PCR片段。

Note: M, 0.1～2 Kb molecular mass Marker; 1, 16S rDNA PCR fragment.

图4 菌株X20的16S rDNA扩增

Fig.4 PCR amplification results of X20

2.4.2 菌株X20的分子生物学鉴定 从图4可见，菌株X20的PCR扩增产物大小约为1.5 Kb，与预期值相吻合。将菌株X20的16S rDNA序列通过BLAST同源性分析发现，97%的比对序列都为芽孢杆菌属的菌株，同源性最高的序列中有11个为枯草芽孢杆菌，序列同源性达99%。由图5可知，从NCBI上选取最具代表性的18株菌株构建系统发育树，进行1 000次重复获得自展检验Bootstrap值， 菌株X20与枯草芽孢杆菌落在同一分支上，置信度为89%。因此，可初步判断菌株X20为枯草芽孢杆菌。

图5 菌株X20的系统发育树

Fig.5 Phylogenetic tree of strain X20

3 结论与讨论

从浓香型大曲中分离出一株高液化力细菌X20，其液化力达11.756 g/(g· h)。经16S rDNA鉴定结果显示，该菌株与枯草芽孢杆菌同源性最高，达99%，可初步鉴定为枯草芽孢杆菌。HS-SPME-GC-MS结果显示，菌株X20发酵产物中富含大曲中的重要风味成分，如吡嗪类物质、愈创木酚、苯甲醛等。菌株X20不仅具有高液化力并且其发酵产物中富含大曲中的重要风味成分，可初步确定为大曲的功能菌株。

由于传统优质大曲的生产受到地理、气候、水质等环境条件以及在此环境中滋生和孕育的其他微生物的影响，从而阻碍了制曲生产异地化发展。本研究从名优白酒企业的菌种资源中筛选高液化力功能菌株，进一步改良大曲发酵功能菌群，为制曲生产异地化再现奠定了基础。由于时间关系，仅对其主要功能特性及其代谢产物进行初步探究，关于菌株功能特性和大曲风味成分之间的联系还有待进一步研究。

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(责任编辑： 王 海)

Isolation and Identification of a Bacteria from Luzhou-flavor Daqu

CHEN Xiaoxu1, MING Hongmei1*, LUO Huibo1, XU Defu2,ZHU Lili1, YAO Xia1, XUE Dengwen2

(1.EngineeringofBioengineeringInstitute,SichuanUniversityofScience,Zigong,Sichuan643000; 2.LuzhoulaojiaoCompanyLimited,Luzhou,Sichuan646000,China)

In order to filter out high stress liquefaction bacteria and provide references for Daqu functional bacteria flora construction, the authors usedplate screening test, solid state fermentation experiment, 16S rDNA and HS-SPME-GC-MS to seek the relationship between mieroorganism in Daqu and flower compounds. Results: The bacterial strain X20 had the highest liquefaction ability, up to 11.756 g/(g· h),the 16S rDNA sequence about X20 andBacillussubtilishomology as high as 99%, which could be identified asB.subtilis, the metabolites contained pyrazines, guaiacol, benzaldehyde and some other kinds of daqu important flavor. It could be initially identified as functional strain of Daqu.

Luzhou-flavor Daqu; high liquefaction ability; bacteria; functional strain; HS-SPME-GC-MS;16S rDNA

2015-03-24； 2015-07-01修回

酿酒生物技术及应用四川省重点实验室项目“浓香型大曲优势菌的筛选及微生态制剂的研发”(NJ2011-13)；泸州老窖科研奖学金项目“浓香型大曲中产香微生物的筛选及应用研究”(13ljzk04)；四川省教育厅重点科研项目“浓香型大曲微生态特征及立体制曲工艺优化的研究”(15ZA0219)；四川省大学生创新训练计划项目“浓香型大曲中产香菌的筛选及香曲制备研究”(201410622004)

陈晓旭(1990-)，女，在读硕士，研究方向：发酵工程。E-mail: 623086967@qq.com

*通讯作者：明红梅(1971-)，女，副教授，硕士生导师，从事酿酒生物技术及应用研究。E-mail:839403036@qq.com

1001-3601(2015)07-0374-0110-04

S182； Q93-3; TS261.1

A