UV-B辐射对铁皮石斛叶片光合色素、类黄酮及PAL酶活性的影响

莫运才， 曾令杰， 黄 涵， 冯鸿耀， 叶静微， 李景彪， 周丛然

(广东药学院 中药学院， 广东 广州 510006)



UV-B辐射对铁皮石斛叶片光合色素、类黄酮及PAL酶活性的影响

莫运才， 曾令杰*， 黄 涵， 冯鸿耀， 叶静微， 李景彪， 周丛然

(广东药学院 中药学院， 广东 广州 510006)

为探讨环境中太阳紫外线(UV-B)辐射的增强对铁皮石斛幼苗生理代谢的影响，以药用植物铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为材料，进行5.1 μW/cm2和15.6 μW/cm2强度的UV-B辐射试验，比较铁皮石斛叶片光合色素含量、类黄酮含量和PAL酶活性变化差异。结果表明：在UV-B辐射下，铁皮石斛叶片叶绿素含量均降低，且随着UV-B辐射时间的延长，15.6 μW/cm2的UV-B辐射处理降低幅度越大；在UV-B辐射处理期间，5.1 μW/cm2辐射的类胡萝卜素含量、类黄酮含量和PAL酶活性均高于CK；而15.6 μW/cm2UV-B辐射的类胡萝卜素含量、类黄酮含量和PAL酶活性在第8天达最大值后迅速降低。表明，低强度UV-B辐射下，铁皮石斛可以被诱导合成较多的类胡萝卜素和类黄酮等紫外保护物质以抵抗UV-B辐射，使植株不受到伤害。而高强度长时间的UV-B辐射对铁皮石斛的伤害较大。

铁皮石斛； UV-B辐射； 光合色素； 类黄酮； PAL酶

平流层臭氧层减薄导致太阳紫外线B(UV-B，波长为280～320 nm)辐射量增加[1-3],地表UV-B辐射目前已成为影响植物生长的重要生态因子。UV-B辐射能对植物的光合器官、蛋白质及质膜等造成损伤[4-5]。然而植物在长期的进化过程中，其本身有应对UV-B辐射的保护机制，如增加UV吸收物质含量来抵抗UV-B辐射等[5-6]。铁皮石斛对光敏感，而UV-B辐射对铁皮石斛生长的影响研究目前鲜见报道。因此，试验在模拟不同荫蔽度的野生环境下，研究UV-B辐射强度下铁皮石斛光合色素含量、类黄酮含量和PAL酶活性的变化，探讨环境中UV-B辐射的增强对铁皮石斛幼苗生理代谢的影响，为铁皮石斛的仿野生栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 铁皮石斛幼苗的培养

在实验室培育的铁皮石斛无菌幼苗中，挑选色绿、健壮、高5～6 cm、生长状态基本一致的幼苗转移到培养基为1/2 MS+2.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的塑料杯中，在温度(25±2)℃，2 000 lx光照强度的培养箱中培养，每天光照12 h。培养一段时间后，筛选生长状况基本一致的组培苗进行UV-B辐照试验。

1.2 试验设计

试验共3个处理，即幼苗在日光灯照射下，进行强度分别为5.1 μW/cm2(处理1)和15.6 μW/cm2(处理2)的UV-B辐照，每天4 h，以不辐照为对照。照射后4 d，8 d，12 d和16 d，取铁皮石斛苗叶片测定叶片光合色素含量、类黄酮含量与PAL酶活性，每处理重复3次。UV-B辐照在组培条件下进行。

1.3 测定方法

光合色素含量的测定按照Aron[7]的方法，略作修改，取新鲜的铁皮石斛叶片0.1 g，加入5 mL纯丙酮和少量石英砂，研磨成匀浆，用5 mL 80%的丙酮冲洗研钵，一并转入离心管中，于6 000 r/min离心10 min，分别测定663 nm、645 nm和470 nm处的吸光值。类黄酮含量的测定在Day[8]的方法上略作修改，取新鲜的铁皮石斛叶片0.2 g，用10 mL酸化甲醇(甲醇∶水∶盐酸=79∶20∶1)在4℃下浸提24 h，取上清液测300 nm处的吸光度值。PAL酶活性参考薛应龙[9]的方法，并加以改进，取新鲜的铁皮石斛叶片0.2 g，加5 mL 0.1 mmol/L pH 8.8硼酸缓冲液(内含5 mmol/L巯基乙醇、1 mmol/L EDTA和0.1 g PVP)低温研磨，于10 000 r/min冷冻离心20 min；1 mL酶液+1 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸+2 mL PBS，空白对照不加底物，代之1 mL硼酸缓冲液，置40℃水浴30 min，紫外分光光度计在290 nm处吸收测定，在290 nm处以每1 h吸收0.01(OD)所需酶量为1个活性单位。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛叶片的光合色素

1) 叶绿素a含量。由图1可知，在UV-B辐射处理16 d内，辐照强度为5.1 μW/cm2(处理1)和15.6 μW/cm2(处理2)的叶绿素a含量均低于CK。照射初期，叶绿素a含量变化呈升高趋势，但上升幅度小于CK；照射后期，处理1的叶绿素a含量变化幅度不大，而处理2的则呈急剧下降趋势。照射第16天时，处理1的叶绿素a含量是CK组的92%，而处理2的叶绿素a含量只是CK组的65%，说明，由于长时间UV-B辐射，植物细胞已受到严重破坏，导致叶绿素a合成受阻。

2) 叶绿素b含量。图1表明，在UV-B辐射处理16 d内，处理1和处理2的叶绿素b含量均低于CK，这与叶绿素a含量变化趋势大体一致。照射第16天时，处理1的叶绿素b含量是CK组的91%，而处理2的叶绿素b含量只是CK组的43%。

3) 类胡萝卜素含量。由图1看出，在照射初期，处理1和处理2的类胡萝卜素含量高于CK，且处理2的类胡萝卜素含量高于处理1的；照射后期，处理1的类胡萝卜素含量变化呈缓缓下降趋势，但含量始终高于CK，而处理2则呈急剧下降趋势，最终导致含量低于CK组。照射第16天时，处理1的类胡萝卜素含量是CK的140%，而处理2的类胡萝卜素含量只是CK组的85%。说明，一定剂量一定时间的UV-B辐射能诱导铁皮石斛类胡萝卜素的合成，含量增加，而高强度长时间的UV-B辐射使类胡萝卜素合成受阻。

图1 UV-B辐射后铁皮石斛叶片的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量

Fig.1 Contents of chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoid inD.officinaleseedling leaves under UV-B radiation

2.2 铁皮石斛叶片的类黄酮含量

从图2看出，在照射初期，UV-B辐射处理的类黄酮含量高于CK，且处理1和处理2在第8天达到最大值，处理1>处理2；照射后期，处理1的类黄酮含量变化呈缓缓下降趋势，但含量始终高于CK，而且处理2呈急剧下降趋势，最终导致含量低于CK；照射第16天时，处理1的类黄酮含量是CK的140%，而处理2的类黄酮含量只是CK的82%。说明，在UV-B照射下，处理1铁皮石斛合成较多的类黄酮，能有效吸收低强度的UV-B辐射，减轻UV-B辐射对植物的伤害；而处理2铁皮石斛遭高强度UV-B辐射，造成不可逆的伤害，使其含量急剧降低。

图2 UV-B辐射后铁皮石斛叶片的类黄酮含量

Fig.2 Flavonoids content inD.officinaleseedling leaves under UV-B radiation

图3 UV-B辐射后铁皮石斛叶片的PAL酶活性

Fig.3 PAL activity inD.officinaleseedling leaves under UV-B radiation

2.3 PAL酶活性

从图3可知，照射初期，PAL酶活性处理1>处理2，两者均高于CK，且在第8天达最大值；照射后期，处理1的PAL酶活性变化呈缓缓下降趋势，但活性始终高于CK，而处理2呈急剧下降趋势，最终低于CK。照射第16天时，处理1的PAL酶活性是CK的147%，而处理2是CK的63%。说明，UV-B辐射强度较大以及长时间辐射可能造成铁皮石斛叶片细胞破坏。

3 结论与讨论

1) UV-B辐射对许多植物都有不同程度的影响。叶绿素含量已经被认为是衡量植物受UV-B辐射伤害及植物抗性的重要指标[4]。本研究表明，UV-B照射后，铁皮石斛叶绿素a或叶绿素b含量均低于CK，这与前人的研究结果相一致[10-14]。然而，在UV-B照射初期，叶绿素a和叶绿素b的含量变化呈上升趋势，上升幅度较小，这可能是因为铁皮石斛在受到UV-B照射后，启动了生理防御机制，如增加类胡萝卜素和类黄酮含量，使叶绿素含量不至受到严重的抑制或破坏。另外，照射12 d后，高强度辐射的叶绿素a和叶绿素b含量变化呈急剧下降趋势，而低强度辐射的组呈缓缓下降趋势。这可能是由于UV-B辐射强度较大以及长时间辐射使铁皮石斛自身的生理防御机制受到破坏，无法保护自身细胞正常运行。

2) 类胡萝卜素不仅能拓宽光合作用中的吸收光谱并将吸收的光能传递给叶绿素，而且能通过散失高光强下多余能量来保护叶绿素[15]。本研究发现，UV-B照射初期提高了类胡萝卜素含量，与郭巍等[16]在水稻上的试验和牛传坡等[17]在冬小麦上的试验得到结论一致。随着辐射时间的延长，高强度UV-B辐射类胡萝卜素含量急剧降低(含量低于CK组)，与魏晓雪[18]在红松幼苗得到的研究结论一致。说明，铁皮石斛在高强度UV-B辐射下，叶片细胞遭到破坏。

3) 类黄酮是植物抵御UV-B辐射的一种有效物质，其能吸收(或过滤)进入叶片内的部分紫外光子，减少进入细胞的UV-B辐射，减轻10%细胞受害[19]。在UV-B照射初期，类黄酮含量高于CK，原因是UV-B照射诱导铁皮石斛产生更多的类黄酮，缓解了UV-B辐射的伤害，与李元等[4]和方兴等[20]提出在UV-B照射下，类黄酮含量提高的结论吻合。然而随着辐射时间的延长，高强度UV-B辐射处理其类黄酮含量急剧降低,这与Kinnunen[21]在欧洲赤松针和董新纯[22]在苦荞所得到的研究结论相一致。研究还发现，低强度的UV-B辐射类黄酮含量在UV-B照射第8天后缓缓降低，波动幅度没有高强度辐射的强烈，而且根据铁皮石斛的生长状况，在处理后期，处理1的叶片稍微变紫，而处理2的植株已经表现出不同程度的衰老迹象，如叶子变黄，这说明铁皮石斛可适应低强度的UV-B辐射；而高强度UV-B辐射的处理对铁皮石斛造成不可逆的伤害，这种伤害导致了细胞类黄酮降解加速而合成困难。

4) PAL酶作为植物许多重要次生代谢产物合成的起始酶[23-24]，具有重要的生理意义。研究发现，UV-B照射下，铁皮石斛叶片PAL酶活性变化趋势与类黄酮的大体一致。有研究表明，PAL酶活性和类黄酮含量之间呈显著正相关关系[25]。这可能是由于增强UV-B辐射诱导苯丙氨酸解氨酶活性增强，苯丙氨酸解氨酶作为植物类黄酮合成代谢的起始酶[24]，促进了类黄酮的合成[26]，导致类黄酮含量的增加。

综上所述，低强度UV-B辐射下，铁皮石斛可以合成较多的类胡萝卜素和类黄酮，抵抗UV-B辐射的伤害，从而使得叶片叶绿素含量变化较小。然而高强度UV-B辐射可能破坏了铁皮石斛叶片细胞，植物无法合成紫外吸收物质(如类黄酮)，从而导致叶片叶绿素含量急剧减少。

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(责任编辑： 聂克艳)

Effects of UV-B Radiation on Photosynthetic Pigments, Flavonoids and PAL Activity inDendrobiumofficinale

MO Yuncai, ZENG Lingjie*, HUANG Han, FENG Hongyao,YE Jingwei, LI Jingbiao, ZHOU Congran

(CollegeofMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou,Guangdong510006,China)

To explore the effects of increasing UV-B radiation on physiological metabolism ofD.officinaleseedlings, the changes of contents of photosynthetic pigments, flavonoid as well as PAL activity inD.officinaleseedling leaf under two UV-B radiations, 5.1 W/cm2and 15.6 W/cm2, were studied. Results:Chlorophyll contents in leaf reduced under UV-B radiations, and with persistent radiation, 15.6 W/cm2group had a quicker drop than that in 5.1 W/cm2group. In addition, during the whole radiation, the contents of carotenoid, flavonoid as well as PAL activity in 5.1 W/cm2group were higher than those in CK group; Meanwhile, 15.6 W/cm2group arrived at a peak on 8thday, then dropped rapidly.Analysis indicated that under low-intensity UV-B radiation,D.officinalecould be defended due to UV protection substance like carotenoid and flavonoid, while damaged under high-intensity UV-B radiation.

Dendrobiumofficinale; UV-B radiation; photosynthetic pigment; flavonoids; PAL

2015-01-31； 2015-06-27修回

广东省科技计划重点资助项目“铁皮石斛种质资源的UV-B筛选与良种培育基地建设”(2012A030100012)

莫运才(1991-)，男，在读硕士，研究方向：中药质量评价。E-mail:1210309308@qq.com

*通讯作者：曾令杰(1970-)，男，教授，博士，从事中药材GAP种植与中药质量研究。E-mail:zlj334477@aliyun.com

1001-3601(2015)07-0355-0034-04

S567.23+9

A