香樟与杂种马褂木树叶乙醇提取物对菜青虫的拒食作用

杨超伟， 胡伟华， 夏 莘， 张云岭， 黄文豪

(国家林业局泡桐研究开发中心, 河南 郑州 450003)



香樟与杂种马褂木树叶乙醇提取物对菜青虫的拒食作用

杨超伟， 胡伟华*， 夏 莘， 张云岭， 黄文豪

(国家林业局泡桐研究开发中心, 河南 郑州 450003)

为丰富植物源杀虫剂资源，降低蔬菜产品农药残留风险，提高质量安全，采用选择性叶碟法研究香樟和杂种马褂木的叶片粗提物及其共有的主成分芳樟醇和樟脑对菜青虫的拒食作用。结果表明：香樟和杂种马褂木叶片的乙醇提取物对菜青虫有极显著的拒食作用，拒食反应指数分别为97.74和62.97；芳樟醇和樟脑以2 mg/1.5 cm ID叶碟的剂量使用时，拒食反应指数分别达89.36和39.88。菜青虫依赖嗅觉系统不能识别芳樟醇和樟脑，在2种物质处理叶碟上的取食持续期为30 s左右，表明2种物质具有摄入后的生理毒性。

香樟； 杂种马褂木； 乙醇提取物； 芳樟醇； 樟脑； 菜青虫； 拒食作用

菜青虫(Pierisrapae)是白菜、甘蓝和花椰菜等十字花科叶菜类的严重常发性害虫[1]，蔬菜受害后其商品价值和产量均受到严重影响。当前，各蔬菜产区主要依赖阿维菌素及其结构改良产品进行防治，但对阿维菌素的过分依赖有大面积产生抗性的潜在风险。

有研究发现[2]，现有48万种植食性昆虫绝大多数为单食性和寡食性，理论上讲，用于开发拒食剂的非寄主植物资源大量存在。利用植物源拒食剂调控作物的适口性，可以将食叶类害虫的危害控制在蔬菜受害前，第三级营养层的天敌可以获得无毒素的食物，是一种更安全的替代性方法，能够实现真正意义上的预防为主。

近10年来，针对菜青虫拒食材料筛选的研究非常活跃，如香菜、胡椒、葱、川楝、银杏叶、银杏种皮、杠柳根皮和老鸦皮等[3-8]。然而，上述研究尽管拓宽了拒食材料筛选范围，取得了可喜的进展，但存在取食量下降的问题，其原因可能是因嗅觉驱避、生理毒性等所致[9]，且仅以特定时间内害虫取食量为试验指标并不能确认拒食材料的生物活性。

香樟(Cinnamomumcamphora)和杂种马褂木(Liriodendronchinense×L.tulipiferaLinn.)全株富含精油，其叶和种子粉碎后有浓郁的樟脑气味，具有天然的抗虫性。前期笔者对杂种马褂木的抗虫性作过初步研究[10-11]，通过对目标昆虫的选择试验，确定了杂种马褂木树叶的抽提物对不同昆虫的抗虫作用，但试验并未对其拒食活性以及主要成分的作用机制进行研究。另有文献报道，香樟对菜青虫有拒食活性[12]，但研究内容简单，未对其剂量、主要成分及其作用机制进行研究。为此，笔者于2013年采用选择性叶碟法，针对具有相同成分(芳樟醇和樟脑)的香樟和杂种马褂木树叶的乙醇提取物的拒食活性进行对比，对拒食活性更强的香樟提取物进行剂量反应研究，并对二者主成分的作用活性进行分析，以期丰富植物源拒食剂资源，降低蔬菜产品农药残留风险及提高其质量安全，为植物源拒食剂的研究提供有力依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菜青虫 2013年6月在河南农业大学科教园区花椰菜田采集，放入气候箱中用新鲜的花椰菜叶片饲养备用。

1.1.2 植物材料 香樟和杂种马褂木树叶，分别采于湖北省荆州市香樟基地和中国林科院经济林研究开发中心原阳基地，将叶片自然干燥并粉碎后备用。

1.1.3 试剂 芳樟醇和樟脑(分析纯)分别购买于Fluka Co Ltd.和天津Kermel化学试剂有限公司，无水乙醇购买于天津Kermel化学试剂有限公司。

1.1.4 仪器与设备 气候箱，MLR-351H，日本三洋。(26±2)℃，RH为(75±10)%，14L∶10D。

1.2 试验设计

1.2.1 2种树叶乙醇提取物对菜青虫的拒食活性比较 采用新鲜无虫害的花椰菜叶碟作为取食基质进行选择性叶碟法取食测试。试验前首先将菜青虫4龄幼虫饥饿处理12 h，并将上述2种植物叶粉末用无水乙醇(2 g/15 mL)常温提取1 d，经充分振荡取上清液备用。试验设3个处理，分别以香樟树叶和杂种马褂木叶的提取物及无水乙醇(对照)为处理试剂。测定时，在14 cm ID培养皿底部铺上湿滤纸，用打孔器制备1.5 cm ID叶碟，放入4枚叶碟，其中2枚涂布20 μL提取物作为处理，另外2枚涂布等量无水乙醇作为对照(交叉设置)。每个培养皿引入1头试虫。当对照叶碟被食量在50%～80%时采用透明坐标纸进行取食量测定，每组处理重复20次。

1.2.2 菜青虫对香樟树叶提取物的反应剂量 试验设5个处理，即：将香樟树叶提取液分别稀释1倍、1.5倍、2倍和4倍的4个处理，以及原提取溶剂作为试验的空白对照。测试方法同1.2.1，每处理重复20次。

1.2.3 菜青虫对芳樟醇和樟脑的取食反应 试验设3个处理，即：将芳樟醇和樟脑按100 mg/mL分别溶于无水乙醇进行测试，无水乙醇为对照。试验时每个处理叶碟涂布的样品剂量仍为20 μL(相当于2 mg有效成分)。测试方法同1.2.1，每处理重复20次。

1.2.4 菜青虫对芳樟醇和樟脑的访问频次测定 采用2项选择式测试法，在培养皿内壁边缘放入芳樟醇或樟脑处理的叶碟1枚，每个处理叶碟涂布的样品剂量为20 μL，在沿着直径的另一侧放置1枚未经处理的对照叶碟。然后引入菜青虫1头，立刻放在荧光灯下观察，使荧光灯与2枚叶碟所在的直径平行且位于正上方。观察并记录初次选择的叶碟类型。由于芳樟醇和樟脑具有较强的挥发性，测试时间过长可能会导致气味在培养皿中扩散均匀，故5 min内试虫既不选择处理也不选择对照的即终止试验并重做。通过上述试验观察发现，通常经过饥饿处理12 h，这类不表现出选择性趋向反应的个体不足总数的5%。芳樟醇和樟脑各重复测试50头幼虫。

1.2.5 菜青虫对芳樟醇和樟脑处理叶碟的取食持续期 采用非选择性方法测试菜青虫对芳樟醇和樟脑处理叶碟的取食持续时间，以判断2种物质对菜青虫的拒食是摄入前效应(作用于味觉系统)还是摄入后效应(生理毒性)。试验设3个处理，分别为芳樟醇和樟脑处理及乙醇处理(对照)，每个处理叶碟涂布的样品剂量为20 μL。在培养皿中央放置相应处理的叶碟1枚，引入菜青虫1头，一旦幼虫开始在叶碟上试咬开始计时，直到幼虫离开时终止计时。为了避免取食经历的影响，每头个体仅测试1次。每个处理重复测定20头。

1.3 数据统计与分析

选择性取食数据均采用配对t测验比较处理组内处理和对照被食量差异显著性(a=0.05)，根据Renwick J J A & Huang X P的方法计算拒食反应指数(Feeding deterrence index，FDI)[13]，并对组间的FDI值差异进行方差分析和多重比较。趋向频次采用χ2测验分析，取食持续时间经对数转换后进行方差分析和Duncan氏多重比较。

2 结果与分析

2.1 香樟和杂种马褂木树叶乙醇提取物对菜青虫的拒食活性

从图1可见，2种树叶提取物处理的叶碟被食量均极显著小于对照叶碟(t杂种马褂木=11.265 3，t香樟=20.392 5，P<0.01)，拒食反应指数分别为62.97%和97.74%。说明，杂种马褂木树叶和香樟树叶中均含有菜青虫的拒食活性成分，但香樟树叶更强。试验观察到香樟树叶提取物处理叶碟仅有少量的菜青虫试咬点。

注：**表示处理与对照的差异达极显著水平(P<0.01)

Note: **indicated very significantly different with CK at 0.01 level.

图 1 杂种马褂木和香樟树叶乙醇提取物对菜青虫的拒食活性

Fig.1 Feeding deterrence of the extracts of the hybrid tulip tree andC.camphoraleaves againstP.rapaelarvae

表1 不同剂量香樟树叶提取物对菜青虫的拒食活性

2.2 不同香樟树叶提取物对菜青虫的拒食活性

从表1可见，完全不含香樟树叶提取物的处理组和对照的叶碟被食量没有显著性差异(t= 0.18)，其余处理组的和对照的叶碟被食量之间均存在极显著差异。其中，20 μL时拒食反应指数最高，为FDI=98.08。从组间显著性看，20 μL和15 μL剂量的FDI之间差异不显著，而10 μL与5 μL剂量的FDI之间差异不显著，但前二者剂量的FDI指数显著大于后二者；所有含有香樟树叶的提取物均有一定拒食活性。

2.3 芳樟醇和樟脑对菜青虫的拒食活性

从表2可见，芳樟醇、樟脑的处理组与对照组的叶碟被食量均存在极显著差异，芳樟醇的FDI指数为89.36，樟脑的FDI指数为39.88。说明，芳樟醇的活性更强。

表2 香樟树叶主要挥发物成分对菜青虫的拒食活性

图2 菜青虫对芳樟醇和樟脑处理叶碟的选择频次 和取食持续时间

Fig.2 Choice frequency and initial feeing duration ofP.rapaelarvae to linalool and camphor treated leaf discs

2.4 菜青虫对芳樟醇和樟脑的趋向反应

芳樟醇和樟脑具有较强的挥发性，由此推测其对菜青虫具有嗅觉驱避作用，造成菜青虫取食量下降，因此，测试了菜青虫对2种物质处理花椰菜叶碟的访问频次。从图2可见，与预期结果相反，菜青虫对2种物质处理的与对照的叶碟选择频次之间无显著性差异(χ2芳樟醇=0.08，(χ2樟脑=0.32，(χ20.05=3.84)。说明，2种物质对菜青虫的嗅觉系统没有明显的刺激活性，取食量的下降可能是摄入后的味觉拒食或生理毒性所致。

2.5 菜青虫在芳樟醇和樟脑处理叶碟上的取食持续时间

从图2还可见，菜青虫对3组叶碟的取食持续时间存在极显著差异(F=14.62，F0.05=3.153 1，F0.01=4.984 1)。其中，芳樟醇和樟脑的取食持续时间在30 s左右，二者差异不显著，但均显著低于对照。

3 结论与讨论

研究发现，香樟树叶提取物的拒食活性比杂种马褂木树叶提取物的强；芳樟醇和樟脑2种主成分表现出较强的拒食活性，通过香樟树叶提取物的剂量反应试验，可以解释2种植物材料拒食活性的差异。通过趋性测试和取食持续时间测试发现，芳樟醇和樟脑虽然具有明显可辨的气味，但对菜青虫却没有基于嗅觉系统的驱避作用。然而，该虫对该2种物质处理叶碟的取食持续时间均为30 s左右，显著低于对照。根据Glendining[9]判断标准，纯粹基于味觉系统的驱避作用往往在数秒内就会回避取食，摄入后效应往往在30～60 s发挥作用。因此，可以判定是芳樟醇和樟脑摄入后效应导致菜青虫取食量的下降，而不是驱避作用和基于外周神经系统的摄入前效应所致。此发现对于菜青虫的综合治理具有重要的意义。因为鳞翅目幼虫移动能力较差，其取食位置往往由上一世代雌成虫的产卵选择决定，故基于嗅觉驱避活性的物质仍然难以避免作物受害；基于外周味觉感觉系统的摄入前效应活性的物质长期处理非常容易引起害虫的适应和味觉习惯化现象[18]，而摄入中肠之后发挥生理毒性的物质则失去了行为调控的本意，尽管毒性比化学农药小得多，但仍然有可能对第三营养层的生物造成负面的影响。因此，基于摄入后效应的拒食剂有较大的利用潜力，芳樟醇和樟脑正是属于这种类型的活性成分。这些物质如果还能影响雌成虫的产卵选择，就能在大田应用中以点气味源的方式保护作物免受菜青虫产卵而无需大面积的喷雾处理，但需要未来通过试验进一步验证。

本试验取得进展的关键在于研究对象和供试材料的选择。首先，菜青虫为十字花科的寡食性害虫，对非寄主中的次生代谢物比较敏感；另外，香樟树和马褂木均为富含精油的高大乔木，与十字花科植物具有很远的遗传距离，农田生态系统中，菜青虫与这些植物几乎没有接触的机会。系统发育保守假说认为，寄主植物在系统发育树上的位置对植食者的寄主转移有强烈的限制作用，植食者对多种寄主的利用或者寄主转移局限于近缘的植物，因为近缘植物共享一些植食者再认识和利用其理化性状[13-17]。当前，蔬菜重要害虫菜青虫的拒食剂筛选范围不断扩大，但真正能够用于防治实践替代阿维菌素及类似药剂的活性物质非常少，原因可能就在于选择的非寄主资源多是农田常见的杂草类植物。笔者认为，应当根据植食者-寄主的系统发育保守假说，精选与十字花科植物亲缘关系较远的植物尤其是高大的乔木作为拒食剂的筛选资源。

另外，高等植物往往利用多重防卫机制抵御植食者的攻击，克服后者味觉系统的习惯化现象和进而发生的寄主专化[18]。从植物叶片的提取物和纯化合物的拒食反应指数比较看，芳樟醇和樟脑仅能部分地解释香樟树叶对菜青虫的拒食活性，可能一些含量低的成分对这2种物质起着协同增效的作用。该文仅对2种植物材料中的活性成分进行了定性分析，如果能通过芳樟醇和樟脑二元混剂最佳配比筛选，确定二者是否存在增效性的相互作用，则有可能进一步提高这些物质开发应用的可能性。

致谢：感谢河南农业大学植保学院李为争老师在项目研究中的指导及李惠玲等同学的协助。

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(责任编辑： 王 海)

Antifeeding Activity of the Ethanol Extracts ofCinnamomumcamphoraandLiriodendronchinense×L.tulipiferaAgainstPierisrapae

YANG Chaowei, HU Weihua*, XIA Xin, ZHANG Yunling, HUANG Wenhao

(PaulowniaResearchandDevelopmentCenter,StateForestryAdministration,Zhengzhou,Henan450003,China)

To enrich botanical insecticide resource, reduce the risk of pesticide residue in vegetable products and enhance the quality safety, Using the method of selective leaf disc test, the author tested the antifeeding activity of two species,C.camphoraandL.chinense×L.tulipifera, againstP.rapaelarvae. The common components (linalool and camphor) of the two species were extracted and used in the test. Results: The ethanol extracts of the two species had very significant antifeeding activity for theP.rapaelarvae. The antifeeding indices ofC.camphoraandL.chinense×L.tulipiferawere 97.74 and 62.97, respectively；When the dose of 2 mg per 1.5 cm ID leaf disc for linalool and camphor was used, the antifeeding responses reached 89.36 and 39.88, respectively. The larvae used in the test could not recognize the difference between linalool and camphor by olfactory feeling. The feeding duration of larva individuals on the treated leaf discs containing linalool or camphor was about 30 s, suggesting that the two common major components of the two species had physiological toxicity after ingested.

Cinnamomumcamphora;Liriodendronchinense×L.tulipifera; ethanol extract; linalool; camphor;Pierisrapae; antifeeding activity

2014-06-20； 2015-07-06修回

河南省重点科技攻关计划项目“植物源蔬菜害虫调控剂的研究”(112102110037)

杨超伟(1982-)，男，工程师，从事经济林培育研究。E-mail：ycw371@126.com

*通讯作者:胡伟华(1964-)，女，副研究员，从事植物内含物研究。E-mail：hua64@sohu.com

1001-3601(2015)07-0364-0068-04

S482.3+9； S433.4

A