火鹤AaSERK基因克隆及其在体细胞胚胎发生中的表达分析

田 娜,王爱香,张克中,崔金腾,贾月慧

(北京农学院 园林学院,北京 102206)

火鹤AaSERK基因克隆及其在体细胞胚胎发生中的表达分析

田 娜,王爱香,张克中*,崔金腾,贾月慧

(北京农学院 园林学院,北京 102206)

为了探讨体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶(SERK)基因在火鹤体细胞胚胎发生中的作用,以火鹤胚性愈伤组织为材料,利用RT-PCR结合RACE技术,克隆了火鹤体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶基因(AaSERK),通过实时荧光定量PCR(Real time-PCR)技术分析了AaSERK的相对表达量。结果显示:(1)该基因全长为1 949 bp,包含1 866 bp开放阅读框,编码蛋白由622个氨基酸组成。(2)预测该基因具有SERK家族典型的结构域:1个信号肽、1个亮氨酸拉链结构域、5个富亮氨酸重复序列结构域、1个SPP基序、1个跨膜结构域、含11个亚区的激酶结构域、1个C端结构域。DNAMAN分析显示,该基因编码的氨基酸序列与其它植物的一致性达到65%～89%。(3)在离体诱导体细胞胚胎发生的各阶段中,AaSERK基因在诱导阶段及发育培养阶段微弱表达或者几乎不表达,在继代培养第30天的胚性愈伤组织中表达量最高。推测该基因可以作为火鹤体细胞胚胎发生的一个标记基因。

火鹤;基因克隆;AaSERK基因;体细胞胚胎发生

火鹤(Anthuriumandraeanum)是经济价值较高的重要观赏植物之一,目前多通过组培再生不定芽方式繁育种苗,少见通过体细胞胚胎发生方式繁育组培苗。体细胞胚胎发生方式繁育组培苗具有如下优点:再生植株起源于单个胚性细胞,不会出现遗传嵌合;结合液体悬浮培养或生物反应器,能高通量生产火鹤种苗;重现胚胎发生途径,再生苗生理年龄较小、生活力更强。

现已发现,许多基因参与体细胞胚胎发生的调控,例如SERK基因[1]、LEAFYCOTYLEDON基因[2]、BABYBOOM基因[3]、AGAMOUS-Like15[4]、ARF5a基因[5]等,但这些基因多是在体细胞胚胎发生后才起作用。只有类受体蛋白激酶(somatic embryogenesis receptor-like kinase,SERK)基因是在体细胞由营养生长向胚性生长的转化中以及早期的体细胞胚胎发生中起作用。人们最初在胡萝卜(Daucuscarota)中发现SERK基因,发现其在胚性细胞中表达且只表达到球形胚时期,在非胚性细胞及球形期后的体细胞胚中不表达。因此,SERK基因被认为是胡萝卜体胞胚发生的标记基因[1]。后来,人们在鸭茅(Dactylisglomerata)[6]、蜜桔(Citrusunshiu)[7]、仙客来(Cyclamenpersicum)[8]、马尾松(Pinusmassoniana)[9]等植物中,均发现SERK基因也具有标记成胚能力的作用。目前,已经从多种植物中克隆到SERK基因[6-11],但火鹤AaSERK基因的研究还未见报道,对于AaSERK基因与火鹤体细胞胚胎发生之间的机理研究也未见报道。若能克隆火鹤AaSERK基因,有可能建立火鹤体细胞胚胎发生的分子标记,为火鹤体细胞胚胎发生分子机理研究提供线索。前期研究中,我们已初步建立了火鹤‘阿拉巴马’体细胞胚胎发生的形态学标记和细胞学标记的关联体系[12]。

本研究以火鹤胚性愈伤组织为材料,采用RACE技术克隆火鹤AaSERK基因,检测其在在诱导、继代、发育阶段的表达模式,为研究火鹤体细胞胚胎发生分子机理提供线索。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料来源于北京农学院火鹤种质资源圃收集的火鹤盆栽品种‘阿拉巴马’。

胚性愈伤组织的获得:参照先前的研究[12],火鹤幼嫩叶片切块接种到1/2 MS+0.6 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培养基,黑暗培养2个月左右,获得光滑紧实愈伤组织(诱导阶段);将上述愈伤组织切割后转至1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA培养基上,培养1个月后,获得粗糙疏松愈伤组织,经镜检为胚性愈伤组织[12](继代培养阶段);胚性愈伤组织转至1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA培养基上,通过胚状体成苗方式产生根芽齐全幼苗(发育阶段)。以继代培养阶段获得的胚性愈伤组织为材料,进行火鹤SERK基因的克隆。

1.2 试验方法

1.2.1 火鹤AaSERK基因保守片段的扩增 以火鹤胚性愈伤组织为材料,采用改良CTAB法提取总RNA。30 μL RNAse-free水溶解RNA,1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度。

采用TaKaRa公司的反转录试剂盒进行第一链cDNA的合成。参考扩增胡萝卜及玉米SERK保守序列所用简并引物[1,12]设计本研究引物。共应用到3条上游引物和2条下游引物(表1),组成6个引物对:SERK-R1和SERK-F3,SERK-R1和SERK-F4,SERK-R1和SERK-F5,SERK-R2和SERK-F3,SERK-R2和SERK-F4,SERK-R2和SERK-F5。扩增反应体系为:第一链cDNA 1.0 μL,2×TaqGreen Mix 12.5 μL,上游引物1.0 μL,下游引物1.0 μL。将混合物混匀,短暂离心后,放入已预热的PCR仪中执行以下反应:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性40 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,38个循环,72 ℃延伸10 min,4 ℃条件下保存。PCR完成后,将产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳分离(图1,A),按照北京全式金生物技术有限公司说明书切胶回收该片段,将回收的片段连接到pMD18-T载体上(TaKaRa),连接产物转化到top10感受态细胞中,挑取阳性克隆送上海英俊基因测序中心进行测序。保守片段的测序结果为后续的3′端和5′端引物设计做准备。

1.2.2 cDNA末端扩增 根据已经获得的保守片段分别设计3′端和5′端克隆的基因特异性引物(表1),以火鹤胚性愈伤组织提取的RNA为材料,分别进行3′-RACE扩增和5′-RACE扩增。相关扩增反应均按TaKaRa公司的3′-RACE-Full Length cDNA Kit(D314)和5′-RACE -Full Length cDNA Kit(D315)说明书进行。这些反应包括:3′-RACE的反转录反应,Outer PCR反应,Inner PCR反应;3′-RACE去磷酸化处理,去帽子反应,5′-RACE Adaptor的连接,反转录反应,Outer PCR反应和Inner PCR反应。将得到的扩增产物进行电泳分离,回收扩增产物并连接至pMD18-T载体,转化到top10感受态细胞中,选阳性克隆测序鉴定。

1.2.3AaSERK基因cDNA全长的克隆 反转录反应采用全式金反转录试剂盒反转录(AT301-01)。将两端测序结果进行拼接得到全长cDNA序列,根据此序列设计扩增完整ORF框的特异引物F02、R02(表1),以火鹤的胚性愈伤组织cDNA为模版进行全长克隆,PCR反应体系为:ddH2O 14.7 μL,缓冲液(含Mg2+,10×Taq酶自带)2.0 μL,dNTPs(10 mmol/L)0.4 μL,上游引物F02(50 ng/μL)0.8 μL,下游引物R02(50 ng/μL)0.8 μL,Taq聚合酶(5 μ/μL)0.2 μL,cDNA模板1.0 μL。反应条件为:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,50 ℃退火35 s,72 ℃延伸120 s,32个循环,72 ℃延伸10 min,4 ℃条件下保存。目的片段与T-载体连接、转化大肠杆菌E.coliTop10、阳性转化菌落检测。阳性克隆送上海英俊基因测序中心测序。

1.2.4 荧光定量PCR验证实验 根据得到的AaSERK基因cDNA全长设计实时荧光定量PCR特异引物YG-F1、YG-R1,预期扩增长度为129 bp。PCR反应体系(25 μL):SYBRTMPremix ExTaqⅡ(2×)12.5 μL,YG-F1(10 μmol/L)0.5 μL,YG-R1(10 μmol/L)0.5 μL(表1),DNA模板2.0 μL,ddH2O 9.5 μL。采用如下PCR反应程序:预变性95 ℃ 30 s,95 ℃变性10 s,62 ℃退火30 s,34个循环。将所得产物进行琼脂糖电泳后进行常规切胶回收、连接转化、蓝白斑筛选、菌落PCR,挑取阳性克隆送出测序,经验证为火鹤SERK基因的片段。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明(图2,箭头所指),引物只扩增出预期大小的片段,没有引物二聚体和杂带,可用于实时荧光定量PCR反应。

1.2.5 荧光定量PCR分析 取不同阶段叶片或愈伤组织为材料:诱导培养阶段第10天、第30天的叶片切块边缘,第50天、第70天的愈伤组织;继代培养阶段第10天、第20天、第30天的愈伤组织;发育培养阶段第10天、第20天、第40天、第60天的愈伤组织。每个阶段的样品等量取3份材料,采用改良CTAB法提取RNA,分别检测SERK基因表达量,检测值取3次平均值。以零处理的叶片作为对照,对其11个不同时期培养物的AaSERK表达进行定量分析。PCR反应体系(25 μL):SYBRTMPremix ExTaqⅡ(2×)12.5 μL,YG-F1(10 μmol/L)0.5 μL,YG-R1(10 μmol/L)0.5 μL(表1),DNA模板2.0 μL,ddH2O 9.5 μL。火鹤SERK基因和内参基因(18S rRNA基因)均采用如下PCR反应程序:预变性95 ℃ 30 s;95 ℃变性10 s;62 ℃退火30 s;50个循环。

1.2.6 生物信息学分析 获得cDNA全长序列后,将AaSERK序列在NCBI数据库中用BLAST工具进行比对分析,发现许多相似度较高的序列。用ORF(open reading frame)finder软件寻找开放阅读框;用DNAMAN进行氨基酸翻译和蛋白质疏水性预测,用Protparam软件分析编码蛋白的理化性质;用PredictProtein软件和InterProScan软件分别预测蛋白质二级结构和结构域;应用TMpred软件预测跨膜结构,应用SignaIP软件预测信号肽;运用MEGA4软件构建系统进化树。

表1 PCR扩增所用引物及其序列

2 结果与分析

2.1 火鹤SERK基因的克隆及序列分析

以火鹤叶片胚性愈伤组织的cDNA为模板进行RT-PCR扩增,取6 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR扩增结果显示:引物SERK-R1和SERK-F3扩增得到1 224 bp和825 bp的2条片段(图1,A1),SERK-R1和SERK-F4扩增得到1条762 bp条带(图1,A2),SERK-R1和SERK-F5未扩增到条带(图1,A3),SERK-R2和SERK-F3扩增得到1条922 bp条带(图1,A4),SERK-R2和SERK-F4扩增得到1条436 bp的条带(图1,A5),SERK-R2和SERK-F5未扩增到条带(图1,A6)。BLASTN分析发现,扩增的5条序列中,有4条序列(除825 bp片段外)与其它植物SERK基因具有较高的相似度;762 bp片段与其它植物SERK基因相似度最高,故以其作为3′-RACE和5′-RACE引物设计的参照序列。

通过3′-RACE与5′-RACE扩增,电泳均检测到大小约1 000 bp左右的扩增产物,与预计大小相符,测序后得到了长度分别为1 085 bp(图1,B箭头所指)和1 098 bp(图1,C箭头所指)的火鹤AaSERK基因3′端和5′端序列。

将以上克隆到的3段序列通过DNAMAN拼接后得到一个长度为1 949 bpAaSERK基因全长cDNA序列(图3)。将拼接片段在NCBI上进行ORF Finding查找得到1 869 bp ORF。分别在起始密码子和终止密码子附近设计全长引物,最后扩增得到包括1 869 bp在内的1 949 bp基因全长片段,其中起始密码子位于19 bp处,终止密码子位于1 888 bp处,共编码622个氨基酸(图1,D箭头所指),将相关序列提交GenBank(登录号为KP418564)。

Protparam软件分析表明:AaSERK基因编码蛋白质分子量为68 037.8 D,等电点为5.75,为亲水性蛋白。PredictProtein软件预测表明:编码蛋白的二级结构以环形结构最多,所占比例为59.65%;其次为α-螺旋结构,占25.88%;而β-折叠占的比例较少,仅为14.47%;具有由前24个氨基酸组成的信号肽,是具有3个跨膜螺旋的跨膜蛋白。

InterProScan等软件分析表明:AaSERK具有典型SERK基因结构,包含1个信号肽(signal peptide,SP)、1个亮氨酸拉链结构域(leu zipper,ZIP)、5个富亮氨酸重复序列(leu-rich repeat,LRR)结构域、1个SPP(Ser-Pro-Pro)基序的富脯氨酸结构域,1个跨膜结构域(transmembrane region,TM)、含11个亚区的激酶结构域(kinase domains)和1个C端结构域(图4)。

DNAMAN分析表明,AaSERK基因编码的氨基酸序列与其它植物的一致性达到65%～89%。应用MEGA4软件对火鹤AaSERK与其它植物SERK氨基酸序列进行系统进化分析,结果显示(图5):二穗短柄草、高粱、玉米、小麦等禾本科植物的SERK基因聚在一起,禾本科植物与菠萝(凤梨科)、椰子(棕榈科)及火鹤(天南星科,单子叶植物)聚为一类。蔷薇科、芸香科、茄科等双子叶植物聚为另一类。这与普通分类的结果一致。

图2 实时荧光定量PCR反应M.DL2000;1.PCR扩增产物,箭头所指为目标片段

图1 AaSERK基因扩增结果A.保守区片段;B.3′-RACE;C.5′-RACE;D.cDNA全长;MI.DL1500;M.DL2000;箭头所指为目标片段

图3 火鹤AaSERK cDNA全长核苷酸序列及其推导氨基酸序列标识长方形的碱基序列ATG和TGA分别表示起始密码子和终止密码子

2.2 火鹤SERK基因的表达分析

火鹤AaSERK基因在不同培养阶段材料中的qRT-PCR检测结果表明(图6):在加有2,4-D的诱导培养阶段的第10、30天,几乎检测不到AaSERK表达;此时叶片切块边缘诱导出愈伤组织,但这些愈伤组织经镜检为非胚性愈伤组织[12],可见在火鹤非胚性愈伤组织中,检测不到AaSERK表达。随着诱导培养时间增加到第50、70天,检测到AaSERK少量表达;经镜检,此时愈伤组织已有不定芽原基的分化[12],某些愈伤组织表面甚至长出了不定芽,可见不定芽分化期AsSERK会有少量表达。在撤掉2,4-D的继代培养第10天、第20天,几乎检测不到AaSERK表达。在继代培养第30天,老愈伤组织切块边缘长出新鲜疏松愈伤组织,经镜检新鲜愈伤组织中已分化出大量多细胞原胚[12],鉴定为胚性愈伤组织;我们在此胚性愈伤组织中检测到AaSERK基因的最高表达。进入发育培养阶段,仅在末期(发育培养第40天、第60天)检测到AaSERK基因的微弱表达,此时胚状体已开始进行根芽的分化。可见,火鹤AaSERK基因在旺盛分化多细胞原胚的胚性愈伤组织中大量表达,在器官分化阶段(不定芽分化、胚状体根芽分化)仅少量表达。

图4 不同植物SERK氨基酸序列比对图中从上至下依次代表的是玉米、菠萝、火鹤、二穗短柄草、番木瓜、甜橙、温州蜜桔、椰子、龙眼、湖北海棠、犬蔷薇、西红柿、秘鲁番茄、马铃薯、高粱、小麦中相应的SERK氨基酸序列;序列上部标出的分别为信号肽、亮氨酸拉链结构域、富亮氨酸重复序列结构域、SPP基序的富脯氨酸结构域、跨膜结构域、激酶结构域(其11个亚区用罗马数字标记)、C端结构域;两对半氨酸残基用三角符号标记

图6 火鹤体胚发生过程中AaSERK基因的相对表达I、S、D分别代表诱导培养、继代培养、发育培养阶段;I-10代表诱导培养第10天

3 讨 论

SERK基因最早由Schmidt从胡萝卜中克隆出,他们发现2,4-D处理后,胡萝卜实生苗下胚轴中能发育成体细胞胚的单个感受态细胞开始表达SERK;感受态细胞分裂前膨大到35×90 μm时,检测到SERK表达;当感受态细胞分化成2～8个细胞原胚以及约100个细胞的小球形胚时,SERK均显著表达;当体细胞胚进入球形胚中后期及鱼雷形胚,SERK表达消失[1]。鸭茅中也发现:叶肉组织上单个胚性细胞、2细胞原胚,球形胚均能检测到SERK的表达;球形胚后的棒形胚,仅在茎分生组织处有少量表达[6]。蜜桔CiSERKa基因在简单增殖的愈伤组织中检测不到,但在胚性愈伤组织内能检测到[7]。仙客来(CyclamenpersicumMill.)的CpSERKa和CpSERKb基因,均能在具有胚性发生能力的组织中检测到,而未获得或丧失胚性能力的组织中检测不到表达[8]。因此,SERK基因可能是某些植物体细胞胚胎发生的早期标记基因。

在本研究中,火鹤继代培养第30天获得的新愈伤组织为胚性愈伤组织,里面有大量发育不同步的多细胞原胚[12],而此时我们检测到了AaSERK的最高表达,其相对表达量约是诱导培养第70天非胚性愈伤组织中的10倍。马尾松PmSERK1在诱导培养的非胚性愈伤组织中不表达,而在经继代培养的胚性愈伤组织中表达量很高且逐渐增加,且在培养第20天时达到最高[9]。我们的研究结果与其非常相似。因此,初步确定克隆的火鹤AaSERK基因可作为火鹤体细胞胚胎发生的早期标记基因。

最开始人们认为SERK仅具有标记体细胞胚胎发生的功能,后来发现SERK基因也具有多功能性:其表达与“细胞重新编程”(cellular reprogramming)相关,其通常在“发育转换区域”(developmental transition zones)或“发育转换时期”(developmental transition period)表达量上调[13-17]。本研究中,诱导培养第50和70天,检测到了AaSERK的轻微表达,可能是因为此时愈伤组织开始了芽原基分化;发育培养阶段第40和60天,SERK基因表达有少量上调,可能是因为胚性愈伤组织开始向胚芽和胚根发育。上述分化或发育均是“细胞重新编程”,出现了“发育转换区域”或“发育转换时期”,所以能检测到AaSERK的轻微表达。

本研究在前期研究[12]的基础上,首次从火鹤胚性愈伤组织克隆到了AaSERK基因,并检测到旺盛分化的胚性愈伤组织中高表达,在其它时期不表达或弱表达,初步认为克隆AaSERK基因可作为火鹤体细胞胚胎发生的标记基因。这将为研究火鹤体细胞胚胎发生的分子机理提供线索。

SERK基因属于富亮氨酸重复序列受体类蛋白激酶(leucine-rich repeat sequence receptor-like kinase,LRR-RLK)家族中的第二亚类[18-19]。受配体诱导,SERK基因可能与膜上的其它RLKs形成二聚体或多聚体,引起胞内激酶域磷酸化,激活了下游的信号转导途径。拟南芥中,SERK基因可能通过芸苔素(brassinosteroid,BR)信号转导途径,激发了体细胞胚的发生[20-23]。AaSERK基因通过何种信号转导途径介导火鹤体细胞胚胎发生,将是我们下一步研究的方向。

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(编辑:宋亚珍)

Clone and Expression ofAaSERKGene inAnthuriumandraeanum’s Somatic Embryogenesis

TIAN Na,WANG Aixiang,ZHANG Kezhong*,CUI Jinteng,JIA Yuehui

(College of Landscape,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

To study the function of somatic embryogenesis receptor-like kinase gene (SERK) inAnthuriumandraeanum’ s somatic embryogenesis,we isolated a novelAaSERKgene from the embryogenic callus ofA.andraeanumby reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE).The expression levels ofAaSERKwere analyzed by Real time-PCR.The results showed that:(1)The full-length cDNA ofAaSERKwas 1 949 bp with an open reading frame of 1 866 bp encoding a protein of 622 amino acid residues.(2)It was speculated that theAaSERKwas a typicalSERKgene with one signal peptide,one leucine zipper domain,five Leu-rich repeat(LRR) domains,one SPP motif,one transmembrane domain,the kinase domain with eleven subdomains,and one C-terminal domain.DNAMAN analysis showed that the putative AaSERK amino acid sequence had 65%-89% identity with those of the other plants.(3)In the different stages of somatic embryogenesisinvitro,the expression ofAaSERKwas weak or little in the inducing stage and the developmental stage,but was the highest in the embryogenic callus on the 30th day of the subculture stage.It was speculated that theAaSERKmight be one of the marker genes of somatic embryogenesis inA.andraeanum.

Anthuriumandraeanum;gene cloning;AaSERKgene;somatic embryogenesis

1000-4025(2015)04-0674-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0674

2014-11-25;修改稿收到日期:2015-02-08

北京市科技提升计划(PXM2013-014207-000079,PXM2014-014207-000081);北京市属高等学校创新团队建设项目(IDHT20150503);北京市教委科技创新平台项目(PXM2014-014207-000018);城乡生态环境北京实验室项目(PXM2015-014207-000014)

田 娜(1989-),女,在读硕士研究生,主要从事花卉栽培与育种研究。E-mail:632416963@qq.com

*通信作者:张克中,博士,教授,主要从事花卉育种与产业化研究。E-mail:zkzzxd@vip.sina.com

Q785;Q789

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