不同药渣对平菇多糖含量及抗氧化活性的影响

单金津， 李 伟， 李齐激， 杨小生*

(1.贵州大学 药学院， 贵州 贵阳 550002； 2.贵州省中科院天然产物化学重点实验室, 贵州 贵阳 550002)



不同药渣对平菇多糖含量及抗氧化活性的影响

单金津1,2， 李 伟1,2， 李齐激2， 杨小生1,2*

(1.贵州大学 药学院， 贵州 贵阳 550002； 2.贵州省中科院天然产物化学重点实验室, 贵州 贵阳 550002)

为开发利用中药渣废弃物，合理利用资源，选取药渣废弃物青冈子壳、刺梨果渣、淫羊藿(药渣)、丹参(药渣)、淫羊藿(药渣)+刺梨果渣为不同基质(菌糠)，探讨其对平菇子实体中粗多糖得率、含量及其体外抗氧化活性的影响。结果表明：以淫羊藿药渣为基质，平菇粗多糖得率与含量最高，分别为9.49%和60.47%；以淫羊藿+刺梨为基质的抗氧化活性最强，当平菇多糖浓度为10mg/mL时，其羟基自由基清除率达89.43%，DPPH自由基清除率达95.8%。

药渣； 平菇； 粗多糖； 抗氧化活性

生物废弃物的循环利用，对于环境保护、促进地方经济发展以及生态文明建设均具有重要的意义。民族医药在贵州省得到蓬勃发展，为贵州的支柱产业，并成为贵州五张名片之一。但在生产中药民族药产品过程中，产生了大量的药渣，如仙灵骨葆胶囊每天产生的废药渣有近10 t，至今仍未得到有效处理和利用。采用堆放自然发酵废药渣处理以获得有机肥，对木质纤维组成低的药渣可行，但对于大多草本、木本等药渣无效，总体经济效益不明显。

目前，已有中药材渣批量用于食用菌生产。如毛久庚[1]等发现，于培养基中加入药渣可加快菌丝体生长，提高产量，且其微量元素，矿物质也明显上升；张振宇[2]等发现，于药渣中培养的食用菌粗多糖对NK细胞活性均有显著增强作用；陈今朝[3]等发现，用补肾益寿胶囊药渣为基质对鲍鱼菇营养成分含量有显著影响。但针对中药渣对食用菌子实体多糖在含量和抗氧化活性方面的影响研究未见报道。

食用真菌平菇(Pleurotusostreatus)又名白平菇、侧耳，属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口蘑科，是广泛栽培的食用菌之一[4]。常食平菇能起到改善人体新陈代谢，调节植物神经的作用，对减少人体血清胆固醇，降低血压和防治肝炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、高血压等有较为明显的效果[5]。平菇营养物质丰富，除氨基酸、蛋白质、维生素等常规营养成分外，平菇多糖为其主要的生物活性成分之一[6]。

试验采用废弃量大的粗毛淫羊藿(EpimediuacuminatumFr. )和丹参(SalviamiltiorrhizaBunge.)药渣(仙灵骨葆胶囊的两种主要组成药材)、刺梨果渣(RosaroxburghiiTratt.)(贵州特色大宗药食两用资源)、青冈子壳(Cyclobalanopsisglauca(Thunb.) Oerst.)(淀粉产品废弃物量大)代替平菇栽培种培养基中的木屑作为平菇生长的基质(菌糠)，考察不同药渣对平菇粗多糖含量及其抗氧化活性的影响，以期从平菇功能物质的角度阐述中药药渣和生物废弃物的利用价值，为开发利用中药渣废弃物，合理利用资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、基质与试剂

1.1.1 供试菌种 平菇(Pleurotusostreatus)菌种，贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室保藏。

1.1.2 供试基质 药材粗毛淫羊藿(全植株)和丹参由贵州同济堂制药有限公司提供，参照生产工艺，水提2次后，弃水液留残渣备用；刺梨果渣和青冈子果壳由贵州奇昂生物科技有限公司提供，直接用于试验。

1.1.3 试剂 二苯代苦味基肼自由基(DPPH，百灵威公司)，抗坏血酸(VC上海润捷化学试剂有限公司，20041101)，葡萄糖、正丁醇、氯仿、过磷酸钙、蔗糖、硫酸亚铁、浓硫酸、水杨酸、无水乙醇、H2O2、琼脂、石灰均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HP-8453型紫外可见光光度计 (惠普公司)，FA114型电子天平(上海海康电子仪器厂)，EYELA型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)，BCD-215TS Haier冰箱(青岛海尔股份有限公司)，SW-CJ-IC超净工作台(苏净集团安泰公司制造)，YX-18LM手提式压力蒸汽灭菌锅(江阴滨江医疗设备有限公司)，DHA-C大容量恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)，101-21型电热鼓风干燥箱、DZ-2A型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，QHX 250II人工气候培养箱(上海树立仪器仪表有限公司)。

1.3 培养基配方及制作

1) 母种培养基(PDA斜面)。配方：土豆(去皮)200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL，pH自然。方法：将马铃薯去皮后称取，切碎，置于烧杯中加水煮沸，待马铃薯煮熟用4层纱布过滤于烧杯中，取滤液，再加入琼脂，葡萄糖，加热并不断搅拌。待琼脂完全融化后补足水，煮沸。趁热将培养基按1/4试管体积分装，加塞，成捆包装，121℃，灭菌30 min，制成斜面。

2) 原种培养基。配方：新鲜、优质小麦，阔叶树木屑20%，木屑∶水=1∶1左右，在此基础上，加入总量0.5%过磷酸钙，0.5%蔗糖、1%石灰，在麦粒煮好后连同木屑拌入。方法：称取一定量麦粒，浸泡(夏季24 h，冬季24～48 h)吸水，再煮沸至饱胀无白心，捞出沥干，再加入阔叶树木屑、过磷酸钙、蔗糖、石灰，用小麦水拌匀。装1/2菌袋体积的培养料，封口膜封口，121℃，灭菌2 h。

3) 栽培种培养基。同原种培养基，只将优质小麦量改为10%，阔叶树木屑改为考察药渣或废料(90%)作为基质。

1.4 试验设计

试验始于2013年7月，于贵州省中科院天然产物化学重点实验室完成。共设计5个处理，3个平行，分别以青冈子壳、刺梨果渣、淫羊藿(药渣)、丹参(药渣)、淫羊藿(药渣)+刺梨果渣代替栽培种培养基中的木屑。

1.5 菌种活化和出菇培养[7-8]

1.5.1 菌种活化 将平菇菌种接于母种PDA培养基中，于28℃恒温箱中培养10 d，待菌丝长满试管，选择外表菌丝浓白、粗壮、富有弹性的菌种作为母种培养基。

1.5.2 原种制备 刮取2 cm左右PDA斜面(长满菌丝)接入原种培养基基质中，于28℃，相对湿度70%～80%的人工气候箱中黑暗培养25 d，至其长满菌袋。

1.5.3 栽培种制备 将5种药渣按照栽培种制作方法分别设计3个菌袋，做平行对照。将平菇原种基质(长满菌丝)接入栽培种培养基中，于28℃，相对湿度70%～80%的人工气候箱中黑暗培养30 d，至其长满菌袋。

1.5.4 出菇培养 待栽培种培养基菌丝长至菌袋2/3时，打开封口膜，置于18～24℃，相对湿度85%～95%，通风良好且具有一定的散射光的人工气候箱中培养出菇。

1.6 平菇子实体多糖含量测定

1.6.1 葡萄糖标准储备液的配置[9]准确称取于105℃干燥至恒重的葡萄糖标准样品0.025 0 g，适量水溶解后定量转入250 mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度线，摇匀，即得质量浓度为100 μg/mL葡萄糖标准储备液，用时以水稀释可得不同质量浓度葡萄糖标准溶液。

1.6.2 葡萄糖标准曲线绘制 准确吸取葡萄糖储备液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL和8.0 mL，分别置于8个10 mL棕色容量瓶中，加水定容后摇匀，准确吸取上述溶液各1.0 mL置于试管中，再分别加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，快速加浓硫酸5.0 mL，充分摇匀，室温中静置10 min；另吸取1.0 mL蒸馏水置于试管中，同上操作加苯酚和浓硫酸，作空白溶液。以空白溶液作对照，在490 nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度C(μg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.6.3 平菇多糖的提取

1) 样品处理。从3个平行菌袋中摘取新鲜平菇分别洗净剪碎，放于托盘中，置于40℃鼓风干燥箱中烘干，将烘干的平菇子实体用高速粉碎机粉碎，过80目筛，制得平菇干粉3份，备用[6]。

2) 提取工艺。称取一定量平菇粉→浸提→抽滤→浓缩→除蛋白→离心→80%乙醇沉淀过夜→离心得多糖沉淀[10-11]

称取适量平菇干粉，按料液比1∶40加入蒸馏水，于恒温水浴锅中90℃浸提4 h。用8层纱布过滤2次，再将滤液 3 000 r/min离心20 min，取上清液，旋转蒸发浓缩上清液，按多糖水溶液体积的1/4～1/3加入氯仿∶正丁醇=5∶1的混合液，剧烈振摇20～30 min，离心除去含有蛋白质有机溶剂[12]。再按一定料液比加入95%的乙醇配置成80%的乙醇溶液，静置过夜，离心，干燥沉淀，得平菇粗多糖[13]。

3) 样品溶液的制备及粗多糖含量测定。准确称取平菇多糖0.500 0 g加适量水溶解后移至100 mL容量瓶中，加水至刻度线得质量浓度5 mg/mL平菇多糖溶液。准确移取此溶液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用水稀释定容得待测样品溶液。准确吸取待测样品溶液1.0 mL置于试管中，按照标准曲线制作方法测定吸光度，由回归方程计算平菇粗多糖含量。

粗多糖得率=(粗多糖质量/平菇干粉质量)×100%;粗多糖含量=粗多糖质量浓度×定容体积/供样用粗多糖质量×100%

1.7 平菇多糖抗氧化活性的测定

1.7.1 羟基自由基清除率[14]准确称取平菇多糖配成5.0 mg/mL，用蒸馏水稀释，浓度分别为4.0 mg/mL、3.0 mg/mL、2.0 mg/mL和1.0 mg/mL。利用H2O2与Fe2+混合产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在波长510 nm处有吸收。如果在反应体系中加入有清除羟基自由基能力的物质，与水杨酸竞争羟基自由基，可使有色物质生成量减少。反应体系中含有8.8 mmol/L H2O21 mL、9 mmol/L FeSO41mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL、不同浓度的多糖溶液1 mL，最后加入 H2O2启动反应，以蒸馏水作为参比，在波长510 nm处测定各浓度的吸光度值，以9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇 1 mL、不同浓度的多糖溶液1 mL和1 mL蒸馏水作为多糖的本底吸收值。以VC作为对照组。每个浓度重复3次，取平均值。自由基清除率的计算公式为：

·OH清除率=[A0-(AX-AX0)]/A0×100%

式中，A0为空白对照液吸光度值，即只加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、过氧化氢，不加入平菇多糖溶液的吸光度值；AX为加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、过氧化氢、平菇多糖的吸光度值；AX0为加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、平菇多糖溶液，不加过氧化氢引发反应的吸光度值。

1.7.2 DPPH·清除率[15]称取一定量的平菇多糖，分别用蒸馏水配成浓度为1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，取1 mL样品溶液，加入2 mL 0.2 mmol/mL的DPPH溶液，摇匀，于25℃水浴中加热15 min，以蒸馏水调零，测定517 nm处的吸光值Ai；以1 mL蒸馏水代替样品溶液测得空白吸光度A0；以1 mL样品溶液中加入2 mL蒸馏水，测得样品本体吸光度Aj。同一测定重复3次，取平均值。按下式计算清除率：

清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线绘制

通过试验，计算得标准曲线的线性方程为y=0.008 73x+0.012 4，y为吸光度值A(490 nm)，x为葡萄糖质量浓度(μg/mL)。该线性方程R2=0.998 1，说明葡萄糖在所取浓度范围内其浓度和吸光度呈良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 不同药渣处理的平菇粗多糖得率及含量

由表可知，各处理样品中的多糖含量可观，且不同基质对多糖含量有明显影响。以淫羊藿为基质粗多糖的得率与含量最高，分别为9.49%和60.47%。所有平菇多糖的含量均高于申培丽等[16]报道的多糖含量(26.9%)。

表 不同药渣处理的平菇子实体粗多糖得率及含量

Table The yield and contents of crude polysaccharide ofP.ostreatusfruit body with different substrates

平菇栽培种培养基类型Substrate重量/gWeight粗多糖得率%Yield粗多糖含量%Content青冈子壳C.blakei10.0029.3345.71刺梨R.roxbunghii10.0025.8343.16淫羊藿E.acuminatum10.0019.4960.47丹参S.miltiorrhiza10.0028.0139.87淫羊藿+刺梨10.0005.8453.20 E.acuminatum+R.roxbunghii

2.3 不同药渣处理平菇多糖的抗氧化活性

2.3.1 羟基自由基清除率 由图2A可知，随着多糖浓度的增加，清除羟基自由基的能力呈明显的上升趋势，有量效关系。不同基质下平菇多糖的羟基自由基的抗氧化活性有明显差别。其中，当平菇多糖的浓度为10 mg/mL，基质为淫羊藿+刺梨和丹参时，其清除率虽然低于阳性对照VC，但可达89%左右。

图2 不同药渣处理平菇多糖对羟基自由基和DPPH自由基的清除率

Fig.2 Scavenging rates of polysaccharide ofP.oysteratuson OH radical and DPPH radical

2.3.2 DPPH自由基清除率 由图2B可知，随着多糖浓度的增加，清除DPPH自由基的能力呈明显上升趋势，有量效关系。不同基质下平菇多糖的DPPH抗氧化活性差异明显，以淫羊藿+刺梨为基质获得的平菇粗多糖浓度为8 mg/mL时，清除率达95%左右；在平菇粗多糖浓度为10 mg/mL时，丹参为基质的平菇粗多糖的清除率也可达95%左右。

3 结论与讨论

3.1 结论

以5种不同的中药材渣和生物废弃物作为平菇生长的基质，考察对平菇多糖含量及其抗氧化活性影响研究，发现以淫羊藿药渣为基料，平菇粗多糖得率与含量最高，且不同基质生产的平菇多糖的含量均较高于申培丽等[16]报道的多糖含量(26.9%)，具有研究意义。以淫羊藿+刺梨为基质，平菇粗多糖的抗氧化活性最强。

试验用的药渣基质生产平菇的产量均比用稻草、秸秆为基质的高且口感好(研究结果暂未报道)。综上所述，不同培养基质对平菇子实体粗多糖的得率、含量及其体外抗氧化活性均有影响。本研究结果对中药民族药产业废弃物的有效利用提供科学依据。

3.2 讨论

1) 食用真菌多糖在国际上被称为生物反应调节物(biological response modifier,简称BRM)[17]。目前研究证明，真菌多糖除了具有抗肿瘤[18]、提高免疫力[19]、抑菌[20]等多种生物活性外，其在抗氧化[21]方面也具有显著效果。试验针对不同基质(中药材渣和生物废弃物)对平菇多糖的得率和多糖含量的研究发现，基质对平菇多糖的影响较大，这与木质纤维化的程度高低有关联，如青冈子壳和淫羊藿基质的平菇多糖得率和多糖含量都是较高的，其物质转移转化机制有待进一步研究。

2) 羟基自由基和脂基自由基是在生命活动过程中氧化代谢反应产生的具有代表性的自由基。当机体内自由基过剩时，会引起脂质过氧化、蛋白质变性、DNA链断裂、细胞解体等，可诱发癌症、高血脂症、急慢性炎症、糖尿病、衰老、辐射损伤等疾病[22]。试验针对不同基质对平菇多糖抗氧化活性的研究发现，不同来源的多糖清除自由基能力差异较大。其中，淫羊藿+刺梨渣和丹参基质针对羟基自由基和DPPH自由的清除能力最强。与多糖含量的高低没有线性关系，可能与多糖的组成相关联。不同来源的多糖其单元类型和比例以及与自由基清除能力的关系，有待深入研究。

3) 通过赵爽[23]等研究发现不同平菇品种子实体的多糖含量存在较大差异，且大量文献证明不同药食用真菌抗氧化活性同样存在差异，则药渣对不同品种药食用真菌子实体多糖的含量及抗氧化活性可能也存在差异，为本课题后续研究内容提供思路。

4) 鉴于中药材渣和生物废弃物品种较多，试验涉及只是贵州大量的部分废弃物，研究材料种类有局限是本研究的不足。

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(责任编辑： 孙小岚)

Effects of Different Dregs on Polysaccharides Content and Antioxidant Activity ofPleurotusostreatus

SHAN Jinjin1,2, LI Wei1,2, LI Qiji2, YANG Xiaosheng1,2*

(1.CollegeofPharmacy,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550002; 2.TheKeyLaboratoryofChemistryforNaturalProductsofGuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences,Guiyang,Guizhou550002,China)

In order to develop and utilize the wastes of Chinese medicine residue rationally, the industrial dregs and waste materials including shell ofCyclobalanopsisblakei, residue ofRosaroxbunghii,Epimediuacuminatum(dregs),Salviamiltiorrhiza(dregs),E.acuminatum(dregs) with residue ofR.roxbunghiiwere used as different substrates for cultivation ofP.ostreatus.The effects on yield and content of crude polysaccharide inP.ostreatustogether with antioxidant activity in vitro were investigated. The results showed that the yield (9.49%) and content (60.47%) of crude polysaccharide inP.ostreatuswhich were cultivated inE.acuminatum(dregs) were the highest and also the antioxidant activity of crude polysaccharide ofP.ostreatuswhich were cultivated inE.acuminatum(dregs)with residue ofR.roxbunghiiwas the strongest. When the concentration of polysaccharide inP.ostreatuswas 10 mg/mL,scavenging rate of polysaccharide on OH radical was 89.43% and on DPPH radical was 95.8%.

dregs;Pleurotusostreatus; crude polysaccharide; antioxidant activity

2014-11-20； 2015-06-24修回

贵州省科技计划项目“药渣高值化综合利用关键技术研究与示范” [黔科合NY(2015)3005-1]；贵州省科技创新人才团队建设项目，“贵州省药材品质研究与评价科技创新人才团队”[(2013)4006 ]

单金津(1989-)，女，在读硕士,研究方向:药物化学。E-mail:shanjinjin@yeah.net

*通讯作者:杨小生(1966-)，男，研究员,博士,从事活性天然产物的研究。E-mail:GZCNP@sina.cn

1001-3601(2015)07-0385-0151-04

S38; R914

A