胎儿正常胰腺组织Stathmin1的免疫组化和原位杂交研究

黄 敏 张 旭 余 跃 高 萌 贾一夫 胡 闻

·基础医学·

胎儿正常胰腺组织Stathmin1的免疫组化和原位杂交研究

黄 敏 张 旭 余 跃 高 萌 贾一夫 胡 闻

目的 探讨Stathmin1在胎儿正常胰腺组织中的表达情况。方法收集2012至2014年不同周龄胎儿解剖标本中正常胰腺组织10例，应用免疫组织化学法和原位杂交检测Stathmin1及其mRNA的表达。结果<24周胎儿正常胰腺组织中Stathmin1已有表达，阳性表达率显著低于>24周胎儿胰腺的正常组织(54.72%vs82.41%,P<0.05)；且<24周胎儿正常胰腺组织中Stathmin1 mRNA也已有表达，阳性表达率显著低于>24周胎儿胰腺的正常组织(48.33%vs73.64%,P<0.05)。结论胎儿正常胰腺组织Stathmin1已有表达，随着胎儿的发育而发生变化，其可能参与了胎儿胰腺组织的生长发育。

胎儿；胰腺组织；Stathmin1; 原位杂交；免疫组化

Stathmin1蛋白是一种微管不稳定磷蛋白，在细胞周期对微管系统动力平衡的调节发挥重要作用。研究则表明Stathmin1蛋白在许多类型的人类恶性肿瘤中呈高水平表达，如口腔癌、食道癌、胃癌等[1]。但其在胎儿胰腺组织表达，国内外鲜见报道。本研究应用免疫组化和原位杂交技术观察胎儿正常胰腺组织Stathmin1的表达，为探讨Stathmin1的生理功能提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本来源 本研究选取2012至2014年安徽省立医院病理科标本库中的10例11～37周胎儿解剖标本，其中4例<24周,6例>24周。胎儿解剖标本若有胰腺疾病或继发性胰腺损伤破坏胰腺正常结构完整的病例则剔除。

1.2 主要试剂与探针 鼠抗人Stathmin1 抗体[EP1573Y]ab52630(上海Abcam公司)，浓缩型DAB试剂盒(产品编号ZLI-9017/9018/9019，中杉金桥公司)。Stathmin1 mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德公司，产品编号 MK1814-h),Stathmin1基因寡核苷酸探针序列：5′-TCTT TCACC TGGAT ATCAG AAGAA GCCAT-3′。

1.3 原位杂交检测 石蜡切片经二甲苯常规脱蜡，梯度乙醇脱水。3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，室温下处理30 min。蒸馏水冲洗3次，每次5 min。暴露mRNA的核酸片段，用新鲜配制的胃蛋白酶(1 mL 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶混匀)，在37℃下消化10～30 min。用0.5 M PBS冲洗3次，每次5 min。再用蒸馏水冲洗1次，5 min。湿盒的准备：干的杂交盒底部加20%甘油20 mL以保持湿度。预杂交：滴加预杂交液 20 μL/片在42℃恒温箱内孵育4 h。杂交：甩去多余的液体，滴加杂交液 20 μL/片，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，在42℃恒温箱内孵育14 h。杂交后洗涤：揭开盖玻片，在30～37℃水温的2×SSC 冲洗5 min×2次，0.5×SSC 冲洗15 min×1次, 0.2×SSC 冲洗15 min×1次。滴加封闭液，20 μL/片置于37℃ 30 min，甩去多余液体，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60 min。0.5 M PBS冲洗4次，每次5 min。滴加SABC：37℃ 20 min。0.5M PBS冲洗3次，每次5 min。滴加生物素化过氧化物酶：37℃ 20 min。0.5M PBS冲洗4次，每次5 min。DAB显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

1.4 免疫组织化学染色 脱蜡、水化组织切片。标本置于3%H2O2的去离子水孵育5 min,以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗5 min,共3次。滴加Stathmin1抗体(1 ∶100)于切片上37℃孵育2 h，PBS冲洗2 min,共3次。滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育15 min, PBS冲洗2 min,共3次。将DAB底物工作液滴加于切片上，显微镜下控制显色，自来水终止显色反应。苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。阴性对照：以PBS代替一抗，其余步骤与上述相同。

1.5 结果判定 Stathmin1及其mRNA阳性信号细胞胞浆着色呈棕黄色，高倍镜下随机选取5个视野(每个视野观察细胞数不少于200个)，按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定[2]。①按细胞着色深浅评分：0分，细胞无显色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。②按阳性细胞数百分比：<5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，≥75%为4分。取①、②两项评分的乘积作为总积分，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.6 统计学方法 数据采用SPSS 16.0进行统计分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎儿正常胰腺组织Stathmin1的表达 Stathmin1阳性显色为棕黄色颗粒，位于胞质，见图1。在>24周胎儿正常胰腺组织中呈较高表达，阳性表达率分别为82.41%；而<24周胎儿正常胰腺组织中已有表达，阳性表达率分别为54.72%；两者差异有统计学意义(χ2=8.59,P=0.001)。

2.2 胎儿正常胰腺组织Stathmin1 mRNA的表达 Stathmin1 mRNA在>24周胎儿正常胰腺组织中表达较强，呈弥漫性着色，阳性显色位于胞浆，呈棕黄色颗粒，见图2。Stathmin1 mRNA在>24周胎儿正常胰腺组织中阳性表达率为73.64%，在<24周胎儿正常胰腺组织中已有表达，阳性表达率为48.33%，两者差异有统计学意义(χ2=7.45,P=0.003)。

3 讨论

Stathmin1是近来研究较多的微管不稳定蛋白，在大量的组织和物种中均广泛存在。它与细胞有丝分裂纺锤体的结构和功能关系密切。目前已经证实Stathmin1在包括消化系统恶性肿瘤等多种恶性肿瘤细胞中高水平表达[1]。但目前胎儿正常胰腺组织中Stathmin1 表达的相关研究鲜见报道。

本研究发现，Stathmin1阳性显色为棕黄色颗粒．位于胞质。在>24周胎儿正常胰腺组织中呈较高表达，阳性表达率显著高于<24周胎儿胰腺的正常组织(P<0.05)；且Stathmin1 mRNA在>24周胎儿正常胰腺组织中表达较强，呈弥漫性着色，阳性显色位于胞浆，呈棕黄色颗粒。Stathmin1 mRNA在>24周胎儿正常胰腺组织中阳性表达率显著高于<24周胎儿胰腺的正常组织(P<0.05)。胎儿正常胰腺组织Stathmin1 已有表达，随着胎儿的发育而发生高表达，其可能在胎儿胰腺组织的生长发育中发挥了重要作用。

在正常人体组织中，Stathmin1表达水平在具有较高细胞代谢能力的组织中高，而在较低增殖能力的组织中表达较低。Hanash等[3]在HL60白血病细胞中发现Stathmin1表达明显增高，当细胞被诱导发生分化和细胞增殖明显减慢时，细胞中Stathmin1表达水平降低。在其他几个白血病细胞系中也发现细胞增殖停滞并分化较好时，Stathmin1表达水平降低。Guo等[4]发现，大鼠骨骺干细胞内Stathmin1表达水平高时，细胞增殖；Stathmin1表达被抑制时，细胞增殖减弱，并且发生细胞分化。还有研究发现在神经元细胞、再生的肝细胞、反应性增生的淋巴结细胞等增殖细胞中Stathmin1表达上调[5]，这些与本研究结果一致。

[1] Akhtar J,Wang Z,Jiang WP,et al.Stathmin overexpression identifies high risk for lymphaticmetastatic recurrence in pN0 esophageal squamous cell carcinoma patients[J]. J Gastroenterol Hepatol,2014,29(9):944-950

[2] Gfroerer S,Metzger R,Fiegel H, et al.Differential changes in intrinsic innervation and interstitial cells of Cajal in small bowel atresia in newborns[J].World J Gastroenterol,2010,16(45):5716-5721.

[3] Hanash SM,Strshler JR,Kuick R,et al.Identification of a polypeptide associated with the malignant phenotype in acute leukemia[J].J Biol Chem,1998,273(26):12813-12815.

[4] Guo F,Zhang Y,Chen AM.Effect of Stathmin decoyoligode oxynucIeotjdes on the proliferation and differentiation of precartilainous stem cells[J]. J Huazhong Univ Sci Technol,2007,27(5):557-560.

[5] Niethammer P,Bastiaens P,Karsenti E.Stathmin-tubulin interaction gradients in motile and mitotic cells[J].Science,2004,303(5665):1862-1866.

(2014-11-01 收稿 2014-12-17 修回)

Expression of stathmin 1 in normal fetal pancreatic tissues

HuangMin,ZhangXu,YuYue,etal

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuimedicalUniversity,Hefei230001,China

Objective To explore the expression of stathmin 1 in the normal fetal pancreatic tissues.MethodsFrom 2012 to 2014, 10 fetal specimens of normal pancreatic tissues from dead fetus at different weeks were collected, and the expression of stathmin 1 and its mRNA were detected and observed by immunohistochemistry and in situ hybridization.ResultsThe positive expression rate of stathmin 1 in fetal specimens of pancreatic tissues less than 24 weeks was lower than that of more than 24 weeks (54.72%vs82.41%,P<0.05), so was it with the positive expression rate of Stathmin 1 mRNA in fetal specimens less than 24 weeks (48.33%vs73.64%,P<0.05).ConclusionThe expression of stathmin 1 exists in normal fetal pancreatic tissues, and its expression increases along with developing fetus. It suggests that stathmin 1 may be involved in the development of fetal pancreatic tissues.

Fetus; Pancreatic tissues; Stathmin 1; In situ hybridization; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.02.001