可溶性CD40配体对THP-1细胞增殖及survivin mRNA表达的影响*

封忠昕　章　莹　陈　琦　肖建辉　闵　迅　冯　进

遵义医学院附属医院　1　检验科　2　内分泌科　3　血液内科，贵州省遵义市　563003；　4　贵州省细胞工程重点实验室



可溶性CD40配体对THP-1细胞增殖及survivin mRNA表达的影响*

封忠昕1章莹2陈琦3肖建辉4闵迅1冯进1

遵义医学院附属医院1检验科2内分泌科3血液内科，贵州省遵义市563003；4贵州省细胞工程重点实验室

急性髓细胞白血病(Acute myelogenous leukemia,AML)是成年人最常见的急性白血病，是一组起源于造血干细胞的异质性血液系统恶性肿瘤，白血病细胞大量聚集浸润骨髓及组织器官中，病情极为凶险，可短期内致死。对白血病的发病机制及生物学治疗等研究是较为热门的课题[1～3]。sCD40L属于肿瘤坏死因子(TNF)基因超家族成员，其在肿瘤细胞抗原递呈等方面发挥重要的作用，可显著抑制B淋巴细胞白血病等增殖，导致肿瘤细胞呈现G1期阻滞，诱导肿瘤细胞的凋亡[4，5]。本课题组李杰等[6]前期研究发现，不同浓度的sCD40L与HL-60细胞干预时，4μg/ml作用48h时抑制增殖促进凋亡最为显著，凋亡因子CD95表达量最高，Bcl-2表达量最低，推测可能是通过死亡受体途径和线粒体途径促进HL-60细胞凋亡。sCD40L能否应用于急性粒细胞白血病其他类型，为此笔者研究sCD40L对THP-1细胞的影响，并且通过测定survivin的表达水平及细胞培养液上清中IL-6水平变化，探讨sCD40L可能的作用机制，为人重组sCD40L 能否应用于白血病的治疗提供更多的理论依据。

1材料与方法

1.1材料白血病THP-1细胞株购自中国科学院上海生命研究院细胞资源中心，胎牛血清和RPMI1640购自美国Gibico公司； sCD40L购自以色列ProSpec公司；RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂盒及survivin引物均购自TaKaRa生物工程公司；IL-6酶联免疫分析(ELISA)试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养。THP-1细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置37℃、5%CO2培养箱中，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2实验分组。 THP-1细胞组：不加任何药物干预组；sCD40L实验组：sCD40L浓度0.5、1.0、1.5、2.0和2.5μg/ml；空白调零组：加入 RPMI 1640完全培养基(含10% FBS)。

1.2.3MTT细胞增殖检测。取对数生长期 THP-1 细胞，细胞活力>90%，加入 96 孔培养板中，每孔细胞100μl，总体积为200μl。每组5个复孔，用完全培养液(RPMI 1640培养液+10%胎牛血清)调整培养体积200μl，37℃5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24h，在终止培养前4h每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，培养终止后弃去上清，每孔用150μl DMSO溶解甲月赞颗粒，轻轻震摇10min，置酶联检测仪上测定光密度(OD)值，检测波长570nm。计算公式：抑制率= (1-实验组OD值/细胞对照组OD值)×100%。

1.2.4survivin mRNA表达的测定。按 TaKaRa 说明提取各浓度各时间段的RNA，并按说明进行逆转录，反应体系：

试剂使用量5×PrimeScriptTMBuffer(forRealTime)6.0μlPrimeScriptTMRTEnzymeMixⅠ1.5μlRandom6mers(100μM)1.5μlOligoDtPrimer(50μM)1.5μlTotalRNA19.5μl总反应体积为30μl

37℃15min逆转录，85℃ 5s灭活逆转录酶。逆转录产物cDNA放置-20℃冰箱保存。按说明进行实时荧光定量PCR，取1μl逆转录产物cDNA进行PCR扩增。反应总体积为20μl，内含SYBR®Premix Ex TaqTM10μl，引物混合液(上游、下游引物)1μl，1‰DEPC 水8μl。 预变性 95℃ 30s， 1 Cycle，PCR反应95℃5s；60℃30s，40 Cycles。引物由TaKaRa生物工程公司合成。实验结果以2^(-△△Ct)相对值来反映基因表达的改变。

基因上游引物(5’-3’)下游引物(3’-5’)survivinGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTGCACAGCAGTGTTTGAAATGACAGGβ-actinTGGCACCCAGCACAATGATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA

1.2.5IL-6水平的测定。严格按照人白细胞介素6(IL-6)ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行：酶标包被板上分别设置空白孔、标准孔、待测样品孔，分别加入细胞培养液、稀释后的标准品、待测样品上清各100μl，每孔均设置5个复孔。37℃反应120min,加入第一抗体，37℃反应60min,洗涤后加入酶标抗体工作液，37℃反应30min,洗涤后加入底物工作液，37℃反应15min,后加入终止液，用酶标仪在450nm波长检测吸光度。

2结果

2.1sCD40L 对THP-1细胞增殖的影响5组不同浓度的sCD40L作用THP-1 细胞24h、48h和72h后，结果显示，随着sCD40L浓度增加及作用时间延长，THP-1 细胞增殖抑制率随之增高，与细胞对照组比较具有统计学意义(P<0.05)，表明sCD40L对THP-1 细胞增殖抑制作用具有剂量-时间依赖性。结果见表1。

2.2实时荧光定量PCR测定survivin mRNA水平的变化5组不同浓度的sCD40L作用THP-1 细胞24h、48h和72h后，结果显示，随着sCD40L浓度增加及作用时间延长，survivin mRNA 表达随之下降，与细胞对照组比较具有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

2.3ELISA测定细胞培养上清液中细胞因子IL-6水平的变化5组不同浓度的sCD40L作用THP-1 细胞24h、48h和72h后，结果显示，随着sCD40L浓度增加及作用时间延长，IL-6表达随之下降，与细胞对照组比较具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

表1　sCD40L对THP-1细胞增殖抑制率

注：与细胞对照组比较，★P<0.05。

表2　sCD40L对THP-1 细胞survivin mRNA

注：与细胞对照组比较，★P<0.05。

3讨论

AML是成年人最常见的恶性血液肿瘤，其特征是大量异常增生的白血病细胞浸润导致各器官功能异常，传统的FAB分型和WHO分型各有不同，随着分子检测等技术的广泛应用，治疗手段也不断丰富，探测靶点等治疗是当前研究的热点[7～9]。

CD40配体属于肿瘤坏死因子基因超家族，主要来源于血小板、B细胞、T细胞等，CD40配体可分为sCD40L和膜结合型CD40配体两种[10]。sCD40L是由膜结合型CD40配体裂解而成的，分子量为18KD，主要以活化三聚体的形式存在，该配体通常被认为存在两个功能区：一个是赖氨酸-精氨酸-谷氨酸(KGD)序列，其与血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体相结合；另一个是肿瘤坏死因子(TNF)同源结构域，其与CD40相结合[11]。对于sCD40L的研究多集中于肺癌、胃癌等实体瘤，刘珊等[12]予sCD40L联合长春瑞滨作用于肺腺癌A549细胞，研究发现sCD40L可抑制A549细胞的体外增殖，并不显著增加长春瑞滨诱导的细胞凋亡率，且对周期时相影响不大，推测可能是通过凋亡及周期抑制以外的机制影响长春瑞滨对A549细胞的作用。但有学者持不同观点，王天立等[13]予sCD40L作用于肺腺癌A549细胞发现，sCD40L可引起A549细胞的生长抑制、细胞周期和表型改变，并可引起部分凋亡基因表达的改变。李锐等[4]予sCD40L作用于胃癌细胞株AGS和BGC-823，研究发现通过诱导细胞凋亡和细胞周期调控，可能成为治疗胃癌的新手段。有专家认为， sCD40L为B细胞恶性肿瘤提供了一种新的靶向治疗的可能[5]。本研究表明，各组浓度的sCD40L作用24h、48h、72h后，细胞增殖抑制率较细胞对照组均明显提高，且具有统计学意义(P<0.05)，以2.5μg/ml作用72h抑制率最显著。可认为sCD40L能够抑制THP-1细胞增殖，存在浓度时间依赖性，可能具有抗白血病效应。有实验表明 CD40抗原与其配体 CD40L 配基化作用,可促进慢性B淋巴白血病细胞(B-CLL)的抗凋亡基因survivin表达，也有研究发现白血病细胞在CD40 刺激下可分泌趋化因子IL-6、IL-12 等[14]。

图1　sCD40L对THP-1细胞的IL-6表达的影响

注：与细胞对照组比较，★P<0.05。

survivin是凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)中相对分子量最小的新成员。在正常的成熟组织中不表达或低表达，在病理状态下, 广泛表达于人类各种恶性肿瘤组织中, 如胃癌、大肠癌、白血病和淋巴瘤等肿瘤中[15～17]。

本实验表明，不同浓度sCD40L与THP-1细胞共育24h、48h、72h后，survivin mRNA表达较细胞对照组均有所抑制，且具有统计学意义(P<0.05)，以2.5μg/ml作用72h时survivin mRNA表达最小，具有浓度-时间依赖性。说明sCD40L在体外能够抑制THP-1细胞增殖可能与survivin mRNA表达下调相关。IL-6是一种由纤维母细胞、淋巴细胞和多种肿瘤细胞等产生的常见的细胞因子，可诱导B淋巴细胞、单核细胞等分化，参与炎症反应等，并能促进肿瘤生长，与多发性骨髓瘤关系密切。有研究表明，在癌症患者中，包括宫颈癌、消化道肿瘤中高表达，并与侵袭和转移有关[18，19]。

本实验研究显示，sCD40L与THP-1细胞共育24h、48h、72h后，采用ELISA法测定IL-6的表达较细胞对照组均有所抑制，且具有统计学意义(P<0.05)，以2.5μg/ml作用72h时IL-6表达最小，具有浓度-时间依赖性，推测sCD40L在体外能够抑制THP-1细胞增殖，可能与IL-6表达下调相关。这与熊果酸可减低THP-1细胞中IL-6水平相似[20]。

总之，0.5～2.5μg/ml 浓度的sCD40L与THP-1细胞共育24h、48h、72h后细胞增殖抑制率均有上升，具有浓度-时间依赖性。另外，上述浓度的sCD40L与THP-1细胞共育24h、48h、72h后，survivin mRNA和IL-6表达均有所下调，具有浓度-时间依赖性。这可能提示sCD40L作用THP-1细胞抑制增殖与survivin mRNA及IL-6的下调有关，故推测sCD40L有可能为CML治疗提供新的思路。不过本研究仅对于体外培养THP-1细胞，且实验重复次数和样本有限，另外其体内抗CML效果如何，是否难免产生耐药性等诸多问题仍值得进一步探讨。

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(编辑落落)

摘要目的：研究可溶性CD40配体(Soluble CD40 Ligand,sCD40L)对人白血病 THP-1 细胞增殖的作用，并探讨其对生存素mRNA(survivin mRNA)及白细胞介素6(IL-6)表达的影响。方法：采用MTT 法检测sCD40L孵育THP-1 细胞体外增殖的影响；通过RT-PCR检测survivin mRNA 表达； ELISA测定IL-6的影响。结果：不同浓度的sCD40L对THP-1 细胞增殖有抑制作用，并呈剂量-时间依赖关系；sCD40L对THP-1 细胞survivin及IL-6的表达有明显的抑制作用，并呈剂量-时间依赖性。结论： sCD40L 在体外能够明显抑制 THP-1 细胞增殖，具有剂量-时间依赖性。sCD40L 抑制THP-1 细胞增殖与survivin及IL-6表达相关，并可能与其下调有关。

关键词可溶性CD40配体THP-1细胞增殖survivin白细胞介素6

Effect of Soluble CD40 Ligand on Proliferation of THP-1 Cells and Expression of survivin mRNA

FENG Zhongxin#,ZHANG Ying，CHEN Qi,etal.#DepartmentofClinicalLaboratory，AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,ZunyiCity，GuizhouProvince563003

ABSTRACTObjective:To investigate the effect of sCD40L on proliferation of THP-1 cells and expressions of IL-6 and survivin.Methods:The MTT assay was used to examine the effect of different concentrations of sCD40L on Leukemia THP-1 cells proliferation in vitro at different incubation times; RT-PCR was used to determine the effect of different concentrations of sCD40L on the expression of survivin mRNA in THP-1 cells at different incubation times;ELISA was used to detect changes in cytokine IL-6 levels in the culture supernatants of leukemia THP-1 cells of different concentrations of sCD40L at different incubation times.Results:Different concentrations of sCD40L could all significantly inhibit THP-1 cells proliferation and there was a dose-dependent tendency. sCD40L could suppress the expression of survivin and IL-6,and with dose-dependent manner.Conclusion:sCD40L can significantly inhibit the proliferation of THP-1 cells in vitro, yet it is concentration and time dependent;the mechanisms of sCD40L in inhibiting the proliferation of THP-1 cells and inducing apoptosis in THP-1 cells may be related to their inhibition of IL-6 and survivin expression.

KEY WORDSsCD40L,THP-1,Cell proliferation,survivin,IL-6

收稿日期2015-04-30

中图分类号：R73

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)14-1852-04

*基金项目：贵州省社会发展攻关项目(黔科合SY字[2014]3025号)；贵州省科技厅联合基金(黔科合J字LKZ[2013]55号)。通讯作者：陈琦