慢性阻塞性肺疾病大鼠支气管肺泡灌洗液中CD80、CD86的变化及意义



基础医学研究

慢性阻塞性肺疾病大鼠支气管肺泡灌洗液中CD80、CD86的变化及意义

顾延会，符丹丹，饶习敏，欧阳瑶

(遵义医学院附属医院 呼吸内科，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 研究树突状细胞(DCs)表面因子CD80、CD86在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠造模过程中不同时间段支气管肺泡灌洗液(BALF)中的表达变化，进而深入探讨DCs在COPD发病过程中的作用。方法 将48只大鼠随机分为正常对照组(n=24)和COPD模型组(n=24)。COPD模型组大鼠4周内间断予气道内注入脂多糖(LPS)溶液2次，并予被动吸烟2次/日(注入脂多糖当天除外)。两组大鼠分别于第7、14、21及28天随机选取6只，取其肺组织行病理苏木精-伊红染色(HE染色)以观察病理形态学改变，同时收集BALF，采用流式细胞技术(FCM)检测两组大鼠4个时间段BALF中CD80、CD86的百分比表达。结果 随时间进展COPD大鼠气道炎症和肺气肿表现逐渐出现，且日渐加重，第28天显示明显气道阻塞和肺气肿表现。正常对照组大鼠BALF中CD80和CD86百分比在第7、14、21和28天无明显变化，差异无统计学意义。与正常对照组同时间段相比，COPD模型组第7、14、21、28天BALF中CD80和CD86百分比均有所增加，但第7、14天增加不明显，差异无统计学意义，第21、28天增加明显，差异有统计学意义。结论 利用烟熏及气道内注LPS方法4周后成功建立大鼠COPD模型。COPD模型组大鼠造模早期、中期BALF中CD80、CD86百分比表达不明显，后期增加明显，提示DCs可能随疾病进展逐渐参与到COPD的炎症反应过程中，并导致后期不可逆的疾病进展，同时提示早期预防和治疗可能减少免疫反应引起的炎症反应并阻止疾病进一步进展。

[关键词]慢性阻塞性肺疾病；树突状细胞；肺泡灌洗液； CD80；CD86

慢性阻塞性肺疾病(COPD)简称慢阻肺，是一种严重影响患者生活质量的疾病，其发病率高、经济负担重，且病死率高、致残率高[1]，故揭示COPD的发病机制及有效防治措施已经成为目前研究的主要课题。目前认为吸烟是世界范围内引起COPD最常见的危险因素，长期大量吸烟可以引起气道慢性炎症和肺气肿，反复感染可导致COPD患者病情逐渐加重，且进展快，二者共同作用导致逐渐加重的气流受限和肺功能减退。基于我们以前的研究基础，发现DC参与的免疫炎症反应在COPD的发生发展过程中起到了重要作用[2-6]，但DCs在该发病过程中具体变化趋势不清楚。支气管肺泡灌洗液(BALF)检查在下呼吸道感染性疾病中的研究起到重要作用，利于细胞学和免疫学的检查[7]。故本研究通过4周时间烟熏和气道内注入LPS 2次的联合方法制备COPD大鼠模型，观察COPD大鼠造模过程中的不同时期肺组织病理形态学改变和BALF中DCs表面因子CD80和CD86的变化，以探讨DCs在COPD发病早期、中期或晚期中的作用。

1材料与方法

1.1主要试剂LPS(E.coli 055:B5)由美国Sigma公司提供； PE anti-rat CD80 PE Mouse IgG1、FITC anti-rat CD86及其同型对照FITC Mouse IgG1由eBioscience公司提供。

1.2研究方法

1.2.1动物选取、饲养及模型制备选取SPF级雄性Wistar大鼠48只，约8周龄，体重约(200±20)g，由重庆市大坪医院实验动物中心提供，饲养于符合SPF级实验动物饲养标准的动物房内，均予正常喂养。正常对照组大鼠不予任何干预措施。COPD模型组大鼠第1、15天气道内注入LPS溶液(200 μg/200 μL)0.2 mL，第2～14、16～28天每天被动吸烟2次，每次30 min×12支。

1.2.2标本采集分别于第7、14、21及28天时收集，开胸后立即结扎右肺，取右肺下叶组织约1 cm×1 cm×1 cm大小固定于10%福尔马林中，用于病理切片；充分暴露气管、左主支气管及肺组织，行气管插管，轻柔注入生理盐水约5 mL，混匀并停留5 min，回抽，回收率>80%，共3次，即为BALF标本，离心后上清液用于FCM检查。

1.2.3肺组织病理标本处理和形态学测量方法于我院病理科制作肺组织石蜡包埋切片，常规HE染色，采用计算机图象分析软件IPWin32采图系统对各切片进行采图。

1.2.4应用FCM检测BALF中DCs表面因子CD80、CD86表达BALF标本处理后上清液中加荧光抗体，室温避光25 min，PBS漂洗2次，加固定液至200 μL，上机。

2结果

组别第7天第14天第21天第28天健康对照组252.67±9.87278.76±9.68296.30±10.12324.18±12.89COPD组251.42±14.59247.50±14.76*245.83±15.17*242.31±14.71*

与健康对照组比较，*P<0.01。

2.2两组大鼠不同时间段肺组织病理特点正常对照组镜下观察第7、14、21及28天肺组织表现无明显变化，主要表现为气管表面未见腺体及炎性细胞浸润，肺泡结构正常连续。COPD模型组镜下观察第7、14、21及28天肺组织表现有明显变化[8]，主要表现在气道分泌物逐渐增多，气道慢性炎症、气道阻塞情况、肺泡结构改变等均提示病变逐渐加重。与正常组比，主要表现为第7天：小支气管管壁见少许中性粒和淋巴细胞浸润；第14天：支气管上皮增生增厚，黏膜下腺增生肥大，管壁及周围见大量中性粒和淋巴细胞浸润，腔内见少许分泌物，肺泡壁变薄，见少量断裂；第21天：个别小气道壁的平滑肌层明显增厚，管腔中粘液腺及杯状细胞增生肥大明显，肺组织结构破坏明显；第28天：支气管黏膜上皮脱落,管壁及周围大量单核细胞和淋巴细胞浸润，肺泡壁变薄、断裂,肺泡腔扩大,部分融合成肺大疱。

2.3两组大鼠BALF中CD80、CD86的表达正常对照组大鼠第7、14、21及28天BALF中CD80、CD86的表达变化不大，差异无统计学意义，结果(见表2)。

与正常对照组同时间段相比，COPD模型组大鼠BALF中CD80和CD86百分比在7、14、21、28 d均有所增加，但7、14 d增加不明显，差异无统计学意义，21、28 d增加明显，差异有统计学意义，结果(见表2)。

时间段(d)CD80正常对照组COPD组tPCD86正常对照组COPD组tP70.37±0.210.38±0.170.030.9800.65±0.170.69±0.170.070.980140.38±0.180.51±0.111.560.1500.66±0.080.70±0.140.150.880210.37±0.081.09±0.1410.640.0030.65±0.131.12±0.165.190.006280.36±0.211.45±0.1111.210.0040.67±0.081.73±0.1118.400.005F0.010.3575.5268.17P0.990.790.0060.002

3讨论

COPD是一种以持续性气流受限为特征的可防和可治的常见肺部疾病，主要临床表现为渐进性的呼吸困难[1]。本实验遵循实验动物伦理学理论制备COPD大鼠模型，与正常对照组大鼠相比，COPD模型组一般情况较差，表现出逐渐加重的呼吸困难，符合人类COPD特征性的症状表现；病理HE染色显示随时间进展逐渐出现气道炎症和肺气肿表现，且气道阻塞及肺气肿逐渐加重，第28天肺组织病理显示明显气道阻塞和肺气肿表现，已符合人类COPD肺组织的特征性改变，与以往研究结论[9]相符，综上提示COPD大鼠模型制备成功，为COPD大鼠相关研究打下基础。

近来越来越多的研究显示COPD可能是一种“自身免疫性疾病”[10]，免疫发病过程基本为吸烟初始反应(先天性免疫反应)、T细胞激活和增殖、适应性免疫反应(组织损伤)，发病过程可能与中性粒细胞、巨噬细胞和DCs等炎症细胞参与的异常免疫炎症反应有关[11]， DCs是肺组织中存在的功能强大的专职性抗原递呈细胞(APCs)，决定着免疫反应的发生和走向。关于DCs与COPD相关研究， Demedts等[12]及本课题组[2-6]人体及动物研究均发现COPD气道、肺组织内DCs的含量增加，且与疾病的严重程度呈正相关。但在COPD造模过程中随时间进展气道内DCs表达变化趋势不清。本实验通过测定COPD造模过程中第7、14、21及28天BALF中CD80、CD86的表达变化，进一步探讨DCs在COPD发病早期、中期和后期过程中的作用和意义。实验结果显示正常对照组大鼠第7、14、21及28天BALF中CD80、CD86百分比变化不大，即随时间进展正常对照组大鼠气道内DCs未见明显改变。与正常对照组同时间段相比，COPD模型组大鼠BALF中CD80和CD86百分比在第7、14天有所增加，但变化不明显，即COPD发病早期或中期气道内DCs增加不明显，与烟雾刺激或LPS感染早期，引起的机体反应以先天性免疫反应为主有关，尚未引起明显的免疫炎症反应过程，同时肺组织示肺泡结构未见明显破坏，提示COPD发病早期或中期停止外界刺激可能能阻止疾病进一步进展；CD80和CD86百分比在第21、28天均有所增加，且第28、21天比较亦有所增加，提示COPD发病后期DCs介导并参与免疫炎症反应，同时肺组织HE染色示肺泡结构破坏，且随时间进展逐渐加重，提示COPD发病后期疾病进展迅速且不可逆转。

总之，该实验结果提示随时间进展DCs逐渐参与到COPD的免疫炎症反应过程中，并最终导致不可逆的疾病进展，但在COPD发病早期未出现肺泡结构性改变，故早期预防和治疗可能能减少免疫反应引起的炎症反应并阻止COPD疾病的进一步进展，进一步研究将着重于早期用药对COPD治疗的影响。

[参考文献]

[1] GOLD Executive Committee. Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease(Revised 2011,updated 2015)[EB/OL].[2015-01].www.goldcopd.com.

[2] 符丹丹,欧阳瑶,薛令合.CCL20及DCs在慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰中的变化及意义[J].贵州医药，2011,35(5):408-411.

[3] 符丹丹,欧阳瑶,李书光.慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰中DCs及CCR6的变化及意义[J].山东医药，2011,51(48):7-9.

[4] 符丹丹,欧阳瑶,薛令合.CD40和CD86在慢性阻塞性肺疾病患者中的变化及意义[J]. 遵义医学院学报,2011，34(4):344-347.

[5] 顾延会,欧阳瑶,孙得胜.CCL20抗体对慢性阻塞性肺疾病大鼠外周血和肺泡灌洗液中树突状细胞表面因子表达的影响[J].吉林大学学报：医学版,2013,39(2)：236-240.

[6] 饶习敏,欧阳瑶,顾延会.慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织中树突状细胞的变化[J].遵义医学院学报,2013，36(5):410-412.

[7] 李龙萍,匡晓燕,李化梅，等.238例支气管肺泡灌洗液细胞病理学结果分析与临床意义[J].遵义医学院学报,2015，38(1):80-84.

[8] 顾延会，欧阳瑶.烟熏联合脂多糖制备大鼠慢性阻塞性肺疾病动物模型[J].重庆医学，2012，41(13):1295-1296.

[9] 张莉,李金田,刘永琦,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型病变特点的研究[J].四川动物,2010,29(2):285-287.

[10] Brusselle G G, Joos G F, Bracke K R. New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease[J].Lancet，2011，378：1015-1026.

[11] 蔡柏蔷. 2010年慢性阻塞性肺疾病的研究进展[J].中华结合和呼吸杂志，2011，34(4)：294-298.

[12] Demedts I K, Bracke K R, Van Pottelberge G, et al. Accumulation of Dendritic Cells and Increased CCL20 Levels in the Airways of Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease[J]. Am J Respir Crit Care Med， 2007，175 (10): 998-1005.

[收稿2015-10-10;修回2015-11-12]

(编辑：王静)

The role of CD80 and CD86 in rats with chronic obstructive pulmonary disease

GuYanhui，FuDandan，RaoXimin，OuyangYao

(Department of Respiratory Medicine，The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective To study the expression changes of CD80 and CD86，as the costimulatory molecules of dendritic cell(DCs),in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) at different time periods in rats, and the effect of DCs in this pathogenesis.Methods 48 rats were randomly divided into control group (n=24) and COPD model group (n=24). The rats of COPD model group were established via intra-tracheal injection of lipopolysaccharide (LPS) solution twice in 4 weeks and cigarette inhalation twice daily. Then lung tissue and BALF of rats were investigated at 7-day, 14-day, 21-day and 28-day, respectively,Lung tissue pathology was examined by hematoxylin-eosin (HE staining), while the percentage of CD80 and CD86 was determined by FCM in the BALF.Results There was severe gradually inflammation in the airway and emphysema in COPD model, and the changes of pathology at 28-day were the same as those of COPD patients. There were no significant changes of CD80 and CD86 in BLAF at 7-day, 14-day, 21-day and 28-day in the control groups.Compared with the control group, the percentages of CD80 and CD86 in BALF were increased in COPD groups，but there were no significant increase at 7-day and 14-day，and significantly increased at 21-day and 28-day.Conclusion After four weeks, the COPD rat models were established successfully by this method. The percentages of CD80 and CD86 in BALF of COPD rat model groups were significantly upregulated, especially at 21-day and 28-day , suggesting that DCs may be gradually involved in COPD for inflammatory reaction, leading to the progression and irreversible COPD later. Early prevention and prompt treatment may reduce inflammation caused by the immune response and prevent further disease progression.

[Key words]chronic obstructive pulmonary disease; dendritic cells; BALF; CD80; CD86

[中图法分类号]R563.3

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2015)06-0595-04

[通信作者]欧阳瑶，女，主任医师，硕士生导师，研究方向：COPD发病机制，E-mail:ouyangyao116@sohu.com。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81460008)。