科玛嘉显色培养结合API20C AUX鉴定酵母样真菌的应用价值

科玛嘉显色培养结合API20C AUX鉴定酵母样真菌的应用价值

赵琳琳，卢念红，王江元，艾清*

(吉林大学第一医院二部 检验科，吉林 长春130031)

由于人口的老龄化、广谱抗生素的不规范使用、免疫抑制剂等的应用，侵袭性真菌感染率逐年上升[1，2]。据我国医院感染监测网分析，医院真菌感染率从90年代初期的13.9%上升至90年代后期的24.4%[3，4]。侵袭性真菌病多发生在有严重基础疾病的患者，病死率高[3，4]，而抗真菌药物对深部真菌感染的疗效及其预后很大程度取决于早期诊治[5，6]，因此真菌感染的早期诊断极为重要。大量临床资料表明，真菌感染的流行病学特征已经发生改变[3]，这无疑会增加真菌表型鉴定的难度。临床工作中常用生化反应和科玛嘉显色培养鉴定真菌，但常出现鉴定困难的菌株。本研究以分子生物学方法为“金标准”[7]，对科玛嘉显色培养结合API20C AUX鉴定酵母样真菌的结果准确性进行评估。

1材料与方法

1.1　菌株来源

收集本院微生物室2012年1月至2013年12月临床无菌体液(尿液、腹透液、脑脊液等)和血液标本中分离出的酵母样真菌121株(剔除同一患者同一部位或不同部位标本反复检出的相同菌株)，干滤纸片法-80 ℃保存。

1.2　质控菌株

选取5株标准菌株作为质控菌株：白色假丝酵母菌(ATCC90028)、近平滑假丝酵母菌(ATCC22019)、葡萄牙假丝酵母菌(ATCC0611)、光滑球拟假丝酵母菌(ATCC90030)和热带假丝酵母菌(ATCC1463)，标准菌株购自卫生部临床检验中心。

1.3　试剂与仪器

PCR扩增试剂盒、低熔点琼脂糖、DL 2000 DNA Marker、TBE缓冲液、溴化乙锭溶液(上海生工)，LD5-10B低温离心机(美国赛默飞世尔科技)，T-100PCR仪(美国Bio-rad公司)，FIRE READER XS紫外凝胶成像系统(英国UVITEC公司)，Mini-Sub电泳仪(美国Bio-rad公司)，BC-J80S隔水式恒温培养箱(上海博讯医疗设备厂)。

1.4　真菌显色结合API20C鉴定

①真菌显色培养鉴定：将121株试验菌株和5株标准菌株接种于沙氏培养基上，36 ℃培养24 h-72 h。重复一次上述操作，使真菌充分复苏并分离出单个菌落。挑取沙氏培养基上的单个菌落，接种于科玛嘉显色培养基上，置36 ℃培养，每24 h观察1次显色情况，根据菌落形态和颜色进行判定：绿色、翠绿色为白色假丝酵母菌，蓝灰色、铁灰色为热带假丝酵母菌，粉红色模糊有微毛为克柔假丝酵母菌，紫红色且菌落湿润为光滑球拟假丝酵母菌，白色为无法鉴定的其他假丝酵母菌。②API20C鉴定：对显色培养无法鉴定的其他假丝酵母菌采用API20C方法鉴定，生化谱输入API20C AUX 3.0系统进行判定：鉴定百分率≥80%且T≥0判定为“可接受的鉴定”，鉴定百分率<80%判定为“无鉴定结果”。

1.5　分子生物学鉴定

①DNA的提取采用煮沸法[8]。②选取真菌通用引物ITS1(5-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3)和ITS4(5 -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3)[9,10]对(部分)18S-ITS1-5.8S-ITS2-(部分)28S rDNA进行PCR扩增。PCR反应体系：PCR Master 25 μl，模板DNA 2 μl，上下游引物各2 μl，无菌双蒸水补齐至50 μl。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s为一个循环(共进行35个循环)，72 ℃延伸8 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工测序，测序结果提交GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，通过基因序列对比分析法将菌株准确鉴定到种。

2结果

2.1　显色结合API20C与基因序列分析法鉴定结果

121株菌株经显色培养的鉴定结果有13株无法鉴定，其中108株鉴定结果中有8株鉴定错误。13株无法鉴定菌株经API20C的鉴定结果除1株近平滑假丝酵母菌和2株葡萄牙假丝酵母菌鉴定错误、1株白色假丝酵母菌无鉴定结果外，其余菌株均鉴定正确。显色结合API20C鉴定结果的总体正确率为90.08%。(具体结果见表1)

表1　121株真菌基因序列分析与显色结合API20C鉴定结果

注：( )内为菌株数量，∕为试验未进行

2.2　显色培养与显色结合API20C鉴定结果比较

显色培养与显色结合API20C对121株酵母样真菌的鉴定结果见表2。统计学分析，按α=0.05,χ2=2.84，P>0.05。说明两种鉴定方法无统计学差异，API20C在临床中应用后并没有显著增加酵母样真菌的鉴定正确率。

表2　显色培养与显色结合API20C鉴定结果(株)

注：1为显色不典型白色假丝酵母菌，2为ATCC90028白色假丝酵母菌，3为显色不典型光滑球拟假丝酵母菌，4为ATCC90030光滑球拟假丝酵母菌

图1同一菌种显色不典型与显色典型菌株的显色结果

3讨论

本研究以基因序列分析法鉴定结果为金标准，对显色培养结合API20C的鉴定能力进行评估，优点有以下几点：①菌株收集自2012年1月至2013年12月临床无菌体液和血液标本中分离出的全部酵母样真菌，在菌种构成上与临床符合。而从菌种库中选取的菌株少见菌种的比例常较临床分离菌株高，这与临床实际情况不符。②本研究还原了临床工作中酵母样真菌的鉴定程序：先用显色培养鉴定，仅对显白色和显色不典型菌株用API20C 鉴定。这样得出的结果更能反应显色结合API20C在临床中的应用价值。

科玛嘉显色培养鉴定的结果中，8株菌株显色结果与分子生物学方法鉴定结果不一致，2株常见菌株无法鉴定，可能原因有：①观察时间不足。热带假丝酵母菌观察时间较其他菌种长，常需要72 h或更长时间才能正确鉴定，若时间不足，易错误鉴定为光滑球拟假丝酵母菌。②菌株显色不典型。如本研究中出现的显白色的白色假丝酵母菌(图1.1)，显橘红色的光滑球拟假丝酵母菌(图1.2)。

本研究显色结合API20C鉴定酵母样真菌的正确率为90.08%，说明临床工作中能够将大多数临床分离菌株准确鉴定到种。显色培养鉴定结果与显色结合API20C鉴定结果的差异无统计学意义，说明临床工作应用API20C后，酵母样真菌的鉴定正确率并未出现显著提高。大多数临床微生物室对显色培养可以鉴定的菌株不再进行API20C的鉴定，API20C仅用于显色无法鉴定的菌株。本研究中，经API20C鉴定的13株中，3株鉴定错误，1株无鉴定结果，鉴定正确率仅为69.23%(9/13)，API20C在临床中的应用效果并不理想。

传统的真菌鉴定方法对真菌的鉴定能力有限，而分子生物学的发展使真菌感染的早期诊断成为可能，通过基因序列对比可快速准确将真菌鉴定至种，进而达到指导临床对侵袭性真菌病进行早期诊断和早期用药的目的，但其尚未得到广泛应用。所以，利用PCR技术对真菌进行早期准确的诊断仍是我们今后的研究重点。

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收稿日期：(2014-01-30)

作者简介：艾清，副教授，副主任医师，硕士生导师。

文章编号：1007-4287(2015)01-0022-03

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