Whirlin与不和actin微丝相偶联的espin存在相互作用



Whirlin与不和actin微丝相偶联的espin存在相互作用

王乐1,郝继龙1,韦博2*,唐丽萍3

(1.吉林大学第一医院 眼科，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院 神经外科，吉林 长春130033；

3.吉林汇锋眼科医院 眼科，吉林 长春130000)

Usher 综合征是一种以视力下降和听力渐进受损最终耳聋为主的一种综合征[1-3]。临床上共分为三种类型，其中Usher 综合征II型最为常见。视力受损主要表现为视网膜感光细胞受损后导致视网膜色素变性，视野逐渐变小，听力受损主要表现各种不同程度的听力丧失。众所周知，whirlin,espin,vlgr-1这三个蛋白是组成USH2蛋白复合体的支架蛋白，任何一个蛋白的缺失都会导致USH2疾病的发生[4-6]。Espin是目前被发现USH2蛋白复合体里的一个新成员，并证实与whirlin存在相互作用，但至于whirlin与espin如何相互作用及相互作用的条件仍不是很清楚。

1资料与方法

1.1仪器和试剂细胞培养6孔板、水浴箱、低温超速离心机、-80°冰箱、超声处理器、电泳仪、倒置荧光显微镜、共聚焦显微镜。一抗购于Santa Cruz生物技术公司，蛋白G购于Amersham Biosciences公司。

1.2　实验方法及步骤

1.2.1细胞培养用含有5%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养液培养体外细胞(COS-7细胞和HEK293细胞)。将细胞均匀悬于含10%FBS的DMEM培养液中并平铺培养皿上，24 h后用TurboFect体外转染试剂进行瞬间转染，具体如下：用0.4 μg的质粒稀释在25 μl不含FBS的DMEM培养液中，混匀后，将转染试剂加入培养基中，再与稀释的质粒培养液混合，室温放置15 min，然后孵育10 h，至于倒置显微镜下观察。

1.2.2体外细胞免疫共沉淀和western blotting将有目的蛋白表达的HEK293细胞中，加入裂解液并进行研磨。离心后将上清液中加入蛋白 G摇晃孵育。离心后取上清液，加入一抗摇晃3.5 h，再离心后取的上清液中加入蛋白 G sepharose,摇晃1.5 h。短暂离心后,洗沉淀物4次，再煮沸10 min。Cytochalasin D处理组，是在细胞覆盖率达到80%后，加入4.5μM cytochalasin D/DMEM/5%FBS培养液中室温孵育2h。DMSO(1∶500)处理DMEM/5%FBS里的细胞作为对照组。将所得蛋白进行western blotting,过程如下：用SDS-PAGE胶分离目的蛋白，并提纯后转移到PVDF膜。经过10%脱脂牛奶封闭蛋白1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗4℃孵育1 h，最终观察蛋白条带。

1.2.3荧光染色和共定位分析将细胞放于-80℃冰箱20 min，用再放入5%山羊血清/(Goat Serum,GS)PBS孵育2 h,一抗4℃孵育过夜，用PBS洗10 min，共6次。加入相应二抗/5%GS/ PBS均匀摇晃1 h。共聚焦显微镜下观察并截取目的区域。

2结果

2.1Whirlin与不和actin偶联的espin相作用在GFP-actin和espin共转染的细胞里，espin和actin微丝共定位，espin与肌动蛋白束偶联在一起，说明espin的纤维结构是肌动蛋白束,(图1)。在espin、actin和whirlin共同转染的细胞里,espin的纤维结构仍与actin共定位，但在这些espin/actin微丝里，whirlin表现出不强的信号(图2)。表明当espin和actin微丝结合成束时，whirlin不能与espin有相互作用。众所周知，Cytochalasin D是能够结合肌动蛋白微丝，但是同时又抑制肌动蛋白聚合成束的一种药物[7]。最新的研究表明，它对肌动蛋白微丝的拆卸和聚合非常有效。我们把cytochalasin D加入细胞,发现肌动蛋白束被大量破坏，间接释放了大量espin蛋白。从我们实验的结果中看，用GFP标记espin的蛋白量在免疫沉淀物中增加了4倍。(比较图3上面和图3下面)。这个结果与体外细胞共定位的结果一致(图1和图2)。从而证实当espin与actin微丝不结合成束的时候，whirlin和espin存在相互作用。

图1在GFP-actin和espin共转染的细胞，espin和肌动蛋白微丝共定位

图2　在whirlin,actin和espin共同转染的细胞，whirlin与espin/肌动蛋白微丝极少共定位

2.2　whirlin与actin无相互作用

既然whirlin和espin存在相互作用，而espin又和actin微丝相偶联，那么，whirlin与actin之间有直接作用吗？在whirlin和espin共转染的细胞里，从免疫共沉淀的结果看，whirlin抗体能沉淀下来espin。但是无论我们用Cytochalasin D处理还是不用Cytochalasin D处理细胞，始终没有发现whirlin和actin之间有相互作用(图4)。

在whirlin和GFP-espin转染的细胞里，未经过Cytochalasin D处理的对照组(图3上面)和经过Cytochalasin D处理的治疗组(图3下面)相比,espin蛋白强度显著增加。图3　经过Cytochalasin D处理，whirlin与espin之间　的蛋白相互作用强度显著增加

图4　在GFP标记espin 转染的HEK293细胞里，actin　和GFP-espin相互作用

3讨论

我们用一系列实验证实了whirlin和espin之间的相互作用，发现他们之间相互作用是很微弱。而Espin和actin微丝/单体又是非常高的亲和力[8]。从实验结果来看，用cytochalasin D处理过的细胞，大约也只有1-1.5%的GFP-espin蛋白存在whirlin沉淀物中(图3)，这个微弱的相互作用主要是因为whirlin只与不和actin微丝偶联的espin相互作用(图2，图3)。最终，在espin蛋白与actin蛋白中，二者不结合的蛋白非常少(这里主要指actin单体)，而在这些少量的蛋白才和whirlin蛋白存在相互亲和力，导致whirlin和espin这种弱的相互作用。

参考文献：

[1]Hartong DT,Berson EL,Dryja TP.Retinitis pigmentosa.[J].Lancet,2006,368(9549):1795.

[2]Boughman JA,Vernon M,Shaver KA.Usher syndrome:definition and estimate of prevalence from two high-risk populations.[J].J Chronic Dis，1983,36(8):595.

[3]Keats BJ,Corey DP.The usher syndromes.[J].Am J Med Genet,1999,89(3):158.

[4]Reiners J,Nagel-Wolfrum K,Jurgens K,et al.Molecular basis of human Usher syndrome:deciphering the meshes of the Usher protein network provides insights into the pathomechanisms of the Usher disease.[J].Exp Eye Res,2006,83(1):97.

[5]Yang J,Wang L,Song H,et al.Current understanding of usher syndrome type II.[J].Frontiers in Bioscience in press,2012,17(1):1165.

[6]Williams DS .Usher syndrome:animal models,retinal function of Usher proteins,and prospects for gene therapy.[J].Vision Res .2008,48(3):433.

[7]Yahara I,Harada F,Sekita S,et al.Correlation between effects of 24 different cytochalasins on cellular structures and cellular events and those on actin in vitro.[J].J Cell Biol,1982,92(1):69.

[8]Sekerkova G,Zheng L,Loomis PA,et al.Espins and the actin cytoskeleton of hair cell stereocilia and sensory cell microvilli.[J].Cell Mol Life Sci,2006,63(19):2329.

(收稿日期：2015-04-10)

文章编号：1007-4287(2015)07-1052-03

*通讯作者

基金项目：国家自然青年科学基金项目(81400404)；吉林省科技发展计划资助项目(20140520034JH)；吉林大学白求恩青年科研基金项目(2013205030)