护肝片对小鼠肝纤维化模型中SOD和MDA的影响

白 剑，肖 漓，韩 永，毕丽丽，张丽萍，王学良，石炳毅*

护肝片对小鼠肝纤维化模型中SOD和MDA的影响

白 剑1,2，肖 漓1，韩 永1，毕丽丽1，张丽萍2，王学良2，石炳毅1*

目的 观察护肝片对四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝纤维化模型血清中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影响。方法 将30只雄性SPF级C57B/L小鼠随机分为空白对照组、模型组、护肝片组，每组10只。空白对照组给予100%花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型组给予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；护肝片组给予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并从第3周起给予护肝片1 g/(kg·d)灌胃至第10周。第10周，通过摘除眼球取血，检测小鼠血清中的透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量；检测肝脏组织中SOD和MDA的含量；计算肝脏指数；HE染色观察小鼠肝脏的病理组织学改变。结果 与空白对照组比较，模型组小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST水平升高(P<0.05)，肝脏组织中SOD降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)，肝脏指数增加(P<0.05)，病理检查显示肝细胞坏死并出现脂肪空泡、纤维组织增生和炎细胞浸润；与模型组比较，护肝片组小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT 和AST的水平降低(P<0.05)，肝脏组织中SOD水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，肝脏指数降低(P<0.05)，病理检查显示肝脏组织中无炎性细胞浸润、脂肪空泡和纤维组织沉积。结论 护肝片可以降低肝纤维化小鼠肝组织中MDA的含量，提高SOD含量，实现对纤维化肝脏的保护作用。

护肝片；肝纤维化；SOD；MDA

0 引言

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病发展到一定阶段的共同特征，从病理学角度上看，肝纤维化是肝细胞基质(Extra-cellular matrix，ECM)代谢异常，表现为ECM的合成增多而分解减少，最终导致其大量沉积的过程[1]。ECM主要是肝星状细胞(Hepatocyte stellate cell，HSC)活化后，由HSC异常分泌所致，而HSC异常活化和增生与肝细胞的免疫功能异常有关[2-3]。目前西医治疗肝纤维化尚无特效方法，在代偿期主要以护理为主；失代偿期主要采用支持疗法以控制疾病发展速度。抗肝纤维化的西药如秋水仙碱、青霉胺等，动物实验显示其可在一定程度上改善肝纤维化症状，但在临床应用中疗效并不理想，而且不良反应较多[4]。护肝片是由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子等多味中药制成的复方制剂，也是国家中药保护品种之一。护肝片具有清热解毒、活血化瘀、改善免疫等功能，对于各种类型原因导致的肝纤维化均有一定的治疗作用[5-6]。本实验在此基础上，通过分析护肝片对CCl4所致小鼠肝纤维模型中小鼠血液生化指标和肝脏内SOD、MDA含量的影响，探讨护肝片对肝纤维化小鼠模型的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要仪器 C57B/L小鼠30只，体重(20±1) g，4～5周龄，由辽宁长生生物技术有限公司提供；TBA-40FR全自动生化检测仪购自日本东芝公司；721分光光度计购自上海精密科学仪器厂。

1.2 试剂 水合氯醛、CCl4分析纯均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；鲁花牌花生油；HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C 试剂盒购自上海研晶生物科技有限公司；ALT、AST检测试剂购于四川迈克生物科技有限公司；SOD、MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；护肝片购自黑龙江葵花药业股份有限公司。

1.3 实验分组和动物模型的制备 30只SPF级C57B/L雄性小鼠随机为空白对照组、模型组和护肝片组，每组10只。空白对照组给予100%花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型组给予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；护肝片组给予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并从第3周起给予护肝片1 g/(kg·d)灌胃至第10周。

1.4 组织采样 在第10周通过摘除眼球取血，检测小鼠血清中的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的含量；计算肝脏指数，检测肝脏组织中SOD和MDA的含量；将剩余肝脏组织浸泡于5%的福尔马林溶液中固定，使用HE染色观察小鼠肝脏的病理组织学改变。

2 结果

2.1 护肝片对CCl4肝纤维化小鼠肝脏指数的影响 通过称量小鼠及其肝脏的重量，按照公式计算：肝脏指数=肝脏的重量/小鼠的重量。结果显示，模型组与其他两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组小鼠肝脏指数比较

注：与模型组比较，*P<0.05

2.2 护肝片对CCl4肝纤维化小鼠肝功能指标的影响 三组小鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT、AST含量比较见表2。结果显示，小鼠经CCl4腹腔注射后，血清中的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT、AST含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，提示肝细胞受损，在经过护肝片治疗后，各组相关指标明显下降。

表2 三组小鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT、AST比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与空白对照组比较，#P<0.05

2.3 护肝片对小鼠肝组织内SOD和MDA的影响 小鼠经CCI4腹腔注射后，血清中的SOD水平明显升高，MDA的含量明显降低，提示肝细胞受损，在经过护肝片治疗后，各组相关指标升高。见表3。

表3 护肝片对小鼠肝组织脂质过氧化损伤的影响

注：与模型组比较，*P<0.05；与空白对照组比较，#P<0.05

2.4 护肝片对CCl4肝纤维化小鼠肝脏病理变化的影响 见图1。空白对照组小鼠肝细胞体积较大，呈多面体形，核大而圆，核膜完整，位于细胞中央；肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，板间为不规则的肝窦；肝细胞间连接紧密(图1A)。模型组小鼠肝小叶界限不清，胞质内还可见多个大小不等的脂肪空泡；出现炎性细胞浸润；肝细胞索排列紊乱；肝窦变窄(图1B)。护肝片处理组肝组织结构有较明显改善，肝细胞脂肪变性显著减轻，未见炎性细胞浸润与假小叶形成(图1C)。

图1 三组小鼠肝切片比较(×200)

3 讨论

肝纤维化(Hepatic fibrosis)是由于肝炎病毒、酒精、药物、毒物、血吸虫等多种损伤因素长期刺激肝脏造成的一种常见慢性肝脏疾病，往往是导致肝硬化或肝癌发生的重要始动因素[7-8]。肝纤维化的病因复杂，包括饮食原因引起的肝纤维化(酒精性和高脂高热量性肝纤维化)、先天代谢性肝纤维化(肝豆状核变性)、感染性肝纤维化(病毒性肝炎)、肿瘤性肝纤维化、基因缺陷性肝纤维化、自身免疫性肝纤维化、化学药物性肝纤维化和先天性肝脏畸形肝纤维化等[9]。目前肝硬化模型的建立方法很多，本次实验采用较为稳定的CCl4造模方式，这种方法时间短、简便、成功率高且稳定。CCl4在肝细胞的滑面内质网内可分解为·CCl3和Cl，其中·CCl3可通过共用电子对和细胞色素P450酶的磷脂部分结合，使得细胞色素P450 2E1酶(CYP2E1)活性升高，产生大量活性氧簇(ROS)和RNS[10]，造成肝脏的损伤并最终形成肝纤维化。

中医学认为肝纤维化属于“瘤”、“痹”、“痞”、“积”等范畴，痰瘀互结致使全身气、血、津液运行不畅，阴阳失调，严重时导致肝硬化[11]。护肝片的组方来源于汉代《伤寒论》中的小柴胡汤合茵陈蒿汤加减[12]，由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉、绿豆组成。其中，柴胡中的柴胡皂苷能降低血脂，抑制肝脏脂肪性变；五味子能提高肝细胞活性，增强肝脏功能；茵陈中的茵陈胆碱可将肝脏内脂肪转化为磷脂，从肝脏中运出，使脂肪不能在肝脏中沉积；猪胆汁粉能显著改善脂肪肝患者的消化道症状。可见护肝片可以从多个方面改善全身气、血、津液运行不畅的症状，对肝纤维化有明确的治疗作用。

本研究结果表明，护肝片可以明显改善CCl4肝纤维化模型小鼠血清中肝纤维化、肝功能指标，并使小鼠肝脏的炎性浸润和脂肪空泡消失、汇管区无纤维素沉积，具有明显的保肝作用。MDA是氧化应激常用的标志物，由多不饱和脂肪酸过氧化分解产生，是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，可间接反映机体的自由基代谢变化及细胞的损伤程度[13]。护肝片能够显著降低肝脏组织中的MDA水平，减轻过氧化反应，减轻MDA对机体的损伤。SOD广泛存在于需氧有机体中，是一种抗氧化的酶。机体内SOD和MDA的水平能够反映机体清除自由基的能力和受到自由基损伤的程度。本研究中，小鼠经护肝片治疗8周后，肝脏组织SOD水平显著提高，使细胞中有足够的SOD对抗过氧化反应，清除氧自由基，保护细胞膜免受自由基的攻击，最终实现对肝脏的保护作用。

综上所述，护肝片对于肝纤维化疾病有良好且确切的治疗效果。除了具有疏肝健脾的功效之外，护肝片还可以降低MDA在肝组织内的含量，同时提升SOD水平使细胞中有足够的SOD清除氧自由基，从多方面保护受损肝脏，可作为肝纤维化疾病的临床常规用药加以推广。

[1] 姜冬冬,卢秉久.安络化纤丸对小鼠肝纤维化治疗作用的实验研究[J].临床合理用药,2013,6(6):27-29.

[2] 黄小丽,郭晓云,姜海行,等.Th17及Th1细胞在四氯化碳致肝纤维化小鼠模型中的表达及关系[J].世界华人消化杂志,2014,22(13):1826-1833.

[3] 张晓慧,娄金丽,白丽,等.调节性T细胞对小鼠肝纤维化的促进作用[J].世界华人消化杂志,2014,22(22):3264-3269.

[4] 莫凤珍,孔晓龙,陈方,等.软坚护肝片对大鼠肝纤维化的治疗作用[J].国际药学研究杂志,2013,40(2):219-223.

[5] 白静丽.化瘀通络解毒颗粒对肝纤维化大鼠肝脏PDGFB、α-SMA 表达的影响[J].中国老年学杂志,2014,34(12):3380-3381.

[6] 刘启荣.护肝片在防治抗结核药物所致肝损伤的临床应用[J].中国热带医学,2011,11(12):1520-1521.

[7] 杨黎彬,贾敏,刘少静,等.五味子护肝片对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用[J].贵州医药,2014,38(4):315-317.

[8] 李艳,曹文富.益气化瘀化痰养阴法单剂与合剂对肝纤维化大鼠转化生长因子-β1受体表达的影响[J].中国老年学杂志,2013,33(3):601-604.

[9] 刘佩佩,刘翠芸,付文娟,等.白介素-7对小鼠肝纤维化模型肝组织病理的影响[J].世界华人消化杂志,2014,22(21):3077-3082.

[10]梁道明,胡智兴,罗敏,等.不同剂量CCI4急性肝损伤模型的评价[J].重庆医学,2014,43(1):18-20.

[11]姜福义,章广玲.软肝冲剂抗大鼠肝纤维化的实验研究[J].承德医学院学报,2014,31(3):200-202.

[12]杨琳,梁雪琰,赵洪海,等.护肝片降低CCI4肝损伤模型大鼠丙氨酸氨基转移酶作用及其机制[J].中医药信息,2014,31(3):114-118.

[13]周宗灿.氧化还原信号和氧化应激/还原应激[J].毒理学杂志,2015,29(1):1-14.

Effect of liver-protecting tablets on the expression of SOD and MDA in mice with carbon tetrachloride induced liver fibrosis

BAI Jian1,2,XIAO Li1,HAN Yong1,BI Li-li1,ZHANG Li-ping2,WANG Xue-liang2,SHI Bing-yi1*

(1.Institute of Organ Transplantation,The 309th Hospital of Chinese PLA,Beijng 100091,China;2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China)

Objective To observe the effect of liver-protecting tablets on the expression of super oxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in mice with carbon tetrachloride induced liver fibrosis.Methods Thirty male SPF class C57B/L mice were randomly divided into three groups: control group,model group,liver-protecting tablets group.Mice in control group (n=10) were intraperitoneally injected 100% peanut oil 1 mL/kg,twice a week in total 10 weeks;mice in model group (n=10) were intraperitoneally injected peanut oil containing 20% carbon tetrachloride 1 mL/kg,twice a week in total 10 weeks;mice in liver-protecting tablets group (n=10) were intraperitoneally injected peanut oil containing 20% carbon tetrachloride 1 mL/kg,twice a week in total 10 weeks,and liver-protecting tablet 1 g/(kg·d) was used from the third week to the tenth week.At the tenth week,the blood samples were collected from the mice by removing eyes,the content of hyaluronic acid (HA),layer adhesion protein (LN),collagen type former Ⅲ (PCⅢ),collagen-Ⅳ (Ⅳ-C),alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum were tested.The contents of SOD and MDA in liver tissue were tested;liver index was calculated;pathological and histological changes of mice liver were observed by HE staining.Results Compared with control group,the serum HA,LN,PC Ⅲ,Ⅳ-C,ALT and AST of mice in model group increased more significantly (P<0.05),SOD in liver tissue was lower (P<0.05),MDA in liver tissue was higher (P<0.05),liver index increased (P<0.05),pathological examination showed that there were necrosis in liver cells,fat vacuoles,fibrous tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration in model group.Compared with model group,the serum HA,LN,PC Ⅲ,Ⅳ-C,ALT and AST of mice in liver-protecting tablets group significantly reduced (P<0.05),SOD in liver tissue was higher (P<0.05),MDA in liver tissue was lower (P<0.05),liver index significantly decreased (P<0.05),pathological examination showed that there was no inflammatory infiltration,fat vacuoles and fibrous tissue deposition in liver tissue.Conclusion Liver-protecting tablets can decrease the content of MDA and increase the content of SOD in liver tissue,relieve the liver fibrosis of mice induced by carbon tetrachloride.

Liver-protecting tablets;Liver fibrosis;SOD;MDA

2015-01-14

1.中国人民解放军第三〇九医院器官移植研究所，北京 100091；2.辽宁中医药大学，沈阳 110847

辽宁省自然科学基金(201101142)；辽宁省社会发展攻关计划(2012225018)

10.14053/j.cnki.ppcr.201508008

*通信作者