布比卡因注射致大鼠脊髓损伤模型的制作

李 昕，董有静，张晓宁

布比卡因注射致大鼠脊髓损伤模型的制作

李 昕1，董有静2a*，张晓宁2b

目的 建立动物模型观察脊髓损伤后的病理生理改变，寻找可直接判断脊髓损伤程度的方法，优选出治疗脊髓损伤的最佳方案。方法 暴露大鼠L2-3脊髓后，于脊髓内注射0.5%布比卡因，评价大鼠行为学改变及脊髓形态学改变。观察并记录大鼠后肢行为学改变及脊髓神经元和周围组织的病理改变，评估脊髓损伤程度。结果 与生理盐水注射组(对照组)相比，布比卡因注射组(观察组)大鼠脊髓损伤，表现为术后大鼠BBB评分降低，与对照组比较差异有统计学意义，病理HE染色可见脊髓神经元出现空泡变性及液化坏死。结论 应用腰麻针进行大鼠脊髓穿刺并注射布比卡因的大鼠动物模型，具有稳定可控的脊髓损伤效果。

局麻药；脊髓损伤；腰硬联合麻醉；动物模型

0 引言

腰麻联合硬膜外麻醉(Combined spinal and epidural anesthesia，CSEA)起效迅速,镇痛完善,效果确切,肌肉松弛良好,近年来已广泛应用于妇科、产科、普外科、骨科、泌尿科、肾移植等下腹部及下肢手术。但麻醉效果得到改善的同时,并发症也相对增多，腰硬联合麻醉及腰麻的脊髓损伤是至今尚未充分研究的一种潜在的严重并发症。神经内穿刺注射药物可引起神经损伤[1-2]。损伤主要是由于穿刺针、导管或药物对脊髓的直接物理损伤或化学刺激。目前，局麻药注射致动物脊髓损伤模型的制备鲜有报道。Allen等[3]于1911年开始使用的脊髓撞击伤模型及Sheng等[4]、Uchida等[5]制备的压迫性颈髓损伤模型无法用来研究该种损伤。只有在相同的动物实验条件下，才能研究局麻药对损伤脊髓毒性可能机制。此种脊髓损伤模型的制备，对于临床研究穿刺过程中出现的损伤的诊断以及后续治疗、预后的研究有重要意义。因此，本研究通过建立动物模型观察损伤后病理生理改变，找出可靠、灵敏、可直接判断脊髓损伤程度的方法，优选治疗脊髓损伤的最佳方案，为相关诊断及治疗工作的开展提供保障。

1 材料与方法

1.1 实验动物 体重为180～220 g的SD大鼠24只(中国医科大学)随机分为2组。对照组：手术不给药组；观察组：脊髓布比卡因注射组。每组12只。分别在手术前及手术后1、4、8、15 d进行行为学测试，后肢行为学评分采用改良的BBB分级评分后处死大鼠并取材。

1.2 实验试剂及材料 0.9%氯化钠注射液、0.5%布比卡因、100 g/L水合氯醛、4%多聚甲醛、青霉素、大鼠手术器械、微量注射器等。

1.3 手术 大鼠腹腔注射100 g/L的水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉大鼠，腹腔麻醉后取俯卧位，腰部垫高，四肢及头部固定，将其背部剃毛消毒后铺洞巾，约在腰2～3棘突处作一长约2 cm纵行切口，切开皮肤及皮下组织，钝性分离棘突两侧肌肉及腰2～3棘突间韧带，打开黄韧带暴露脊髓，垂直插入22 G腰麻针，向脊髓注药，药物为0.5%布比卡因4 μL。注射器使用微量注射器。脊髓给药时，以大鼠出现尾动为有效穿刺损伤，5 s内完成给药并拔出针头。剂量选择：参考临床CSEA布比卡因注射剂量，200 g大鼠CSEA用0.5%布比卡因4 μL。注意事项：术后护理，每天给大鼠人工排尿3～4次。术后大鼠出现自食行为，可能增加感染及死亡率。

1.4 行为学测试 行为学测试分别在手术前及手术后1、4、8、15 d进行，使用方法为BBB评分法，该法分级较细致，几乎包括了SCI后大鼠后肢恢复过程中所有行为学变化，且与脊髓损伤的程度高度相符。该法主要是将动物置于环形封闭金属壳内，两个观察者对侧站立观察大鼠后肢运动功能变化，观察期为5 min，观察者依照评分标准进行评分。依据布比卡因注射时的尾动判断注射的有效性及完整性。

1.5 取材 大鼠在行为学测试后水合氯醛麻醉下处死大鼠，在术后4、15 d以L2-3(给药点)为中心取长约0.8 cm脊髓。4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，横向切成5 μm厚的切片，HE染色。

2 结果

2.1 大体观察 各组大鼠术毕行生理盐水1 mL腹腔内注射，以补充失血量。穿刺及药物损伤可引起大鼠脊髓出现不同程度的充血。实验期间观察组大鼠中有1只因全脊髓麻醉呼吸抑制缺氧死亡，死亡率为8.3%，对照组无死亡。

2.2 大鼠行为学改变 术后8 h，所有大鼠均完全清醒，观察组1、4、7、15 d时，BBB评分与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。随着时间的推移，对照组运动恢复快，对照组术后1 d与15 d BBB评分比较差异无统计学意义，表明手术并没有给大鼠带来脊髓神经损伤。观察组运动恢复慢，1、4、7、15 d时，BBB评分与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 术后各个时间点两组大鼠行为学评分(BBB评分)

注：与对照组比较，*P<0.05；与15 d时比较，#P<0.05

2.3 脊髓形态学改变 HE染色切片可见，局麻药注射致大鼠脊髓损伤时，物理损伤及化学损伤同时存在。见图1、图2。

3 讨论

蛛网膜下腔阻滞及腰硬联合阻滞能保持患者清醒，麻醉恢复平稳，且易于术后镇痛，因此，椎管内神经阻滞是临床上常采用的麻醉方法之一。Dusanka等[6]研究发现，早期临床椎管内应用局麻药(盐酸氯普鲁卡因、阿替卡因、丙胺卡因)引起的一过性神经综合征的发生率比利多卡因低。研究发现，椎管内神经阻滞后，出现神经并发症的发生率为1/1 000～1/1 000 000,由此一线工作者对椎管内应用局部麻醉药的安全性产生质疑。临床研究的结果提示：椎管内神经阻滞并发症高于硬膜外阻滞，其中一过性神经综合征的发生率明显升高。引起这些并发症的原因有局麻药化学损伤、直接穿刺或留置导管对神经的损伤、脊髓缺血、感染等，其中最重要的原因包括脊髓直接穿刺损伤和局麻药物毒性作用。

图1 对照组脊髓HE染色

局麻药有不可逆的神经毒性作用。Kitagawa等[7]研究发现，局麻药表面活性分子在高浓度时聚集比例提高，可导致神经细胞膜结构不可逆性破坏。Puljak等[8]发现，将2.0%利多卡因注射到大鼠L4-5脊髓处后出现了痛觉过敏，由于卫星胶质细胞的活化与聚集，导致神经细胞发生了炎症反应。然而，化学结构不同导致局麻药有不同程度的神经毒性。Radwan等[9]体外培养鸡胚脊髓背根神经节细胞(Dorsal root ganglion neurons，DRG)，发现利多卡因、布比卡因、甲哌卡因，罗哌卡因均可使生长中的圆锥萎缩、生长中的神经突起退化，并且这种损伤不可被高浓度神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)逆转，提示甲哌卡因的安全性优于利多卡因和布比卡因。局麻药的神经毒性与其浓度呈正相关，Wang等[10]通过分析患者视觉模拟评分，比较不同浓度布比卡因、罗哌卡因及左旋布比卡因在分娩时的麻醉效果，提示相较于局麻药的种类，其浓度对于麻醉效果的影响更大。本研究参考临床CSEA布比卡因注射剂量，用0.5%布比卡因作为实验药物，旨在指导临床常规用药损伤后的诊断及治疗。

图2 观察组术后4 d脊髓HE染色

本研究结果显示，对照组大鼠术后1、15 d的BBB评分与术前比较差异无统计学意义，说明手术本身没有给大鼠脊髓造成确切损伤，术后护理妥善，手术损伤恢复良好，手术及术后没有加重原有损伤。观察组运动恢复较慢，术后1、4、7、15 d的BBB评分与对照组比较差异有统计学意义，说明大鼠脊髓损伤确实存在；术后1d的BBB评分值最低，随着时间延长，组织机体自行损伤修复，术后15 d的BBB评分值高于术后1 d，但仍未恢复到术前水平，说明没有干预措施的自行损伤修复并不能恢复至术前水平。

由图2A可见，观察组脊髓HE染色切片上可见血管内皮受损，红细胞进入神经元细胞，出血灶边缘可见神经元细胞空泡变性；图2 B显示出血灶边缘出现大面积脊髓组织液化坏死；低倍镜下亦可见脊髓炎性坏死灶及出血坏死带。以上均证实脊髓损伤确切存在。本研究旨在建立损伤模型，因此未确切分辨损伤原因，推测损伤可能是穿刺针直接损伤、局麻药本身的神经毒性抑或是液体脊髓内注射所产生的压力所致，具体机制还需后续相关研究讨论说明。

胡庆生在 1923 年 5 月 18 省教育会所作《公共图书室之需要》的演讲中讲到: “凡私人捐建之图书馆在欧美甚多，如美国钢铁大王康内基能以独立创建大规模之图书馆，鄙人亦甚愿我国之有康内基其人也”。3 胡庆生．公共图书室之需要[J]．浙江公立图书馆年报,1922(8) : 50.

本文研究局麻药所致的脊髓损伤模型建立所采用的方法及观察指标均借鉴了传统的脊髓损伤模型建立过程，观察组与对照组大鼠术后的BBB评分比较差异有统计学意义，证明了该模型的可信性，但与实验室技术成熟的脊髓撞击伤模型和脊髓横断伤模型相比，大鼠的BBB评分及脊髓损伤表现存在显著差异，可能是由于药物种类的选择不妥、剂量不足、手术方法有待改善以及各种可能出现的选择性偏倚等。

综上所述，由于脊髓损伤临床发生率较低，故临床研究受到了极大限制，又因为神经损伤的严重性，预防诊断及治疗不容忽视。本研究应用腰麻针进行大鼠脊髓穿刺并注射布比卡因，引起脊髓损伤，与对照组相比具有明显的脊髓损伤效果。以大鼠作为脊髓穿刺损伤的动物模型重复性好、可控性强，与临床行椎管内阻滞时脊髓穿刺损伤过程相近。本研究为了解临床椎管内穿刺损伤脊髓后的病理生理改变及进一步研究损伤后药物治疗和临床预防神经损伤的发生提供了良好的基础。

[1] Capdevila X,Pirat P,Bringuier S,et al.Continuous peripheral nerveblocks in hospital wards after orthopedic surgery: a multicenter prospective analysis of the quality of postoperative analgesia and complications in 1,416 patients[J].Anesthesiology,2005,103(5):1035-1045.

[2] Jeng CL,Rosenblatt MA.Intraneural injections and regional anesthesia:the known and the unknown[J].Minerva Anestesiol,2011,77(1):54-58.

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Establishment of rats model of spinal cord injury by injection of bupivacaine

LI Xin1,DONG You-jing2a*,ZHANG Xiao-ning2b

(1.Department of Anesthesiology,Liaoning Provincial Tumor Hospital,Shenyang 110042,China;2.a.Department of Anesthesiology,b.Department of Sports Medicine,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To observe the pathophysiological changes after spinal cord injury by establishing the animal model,and to find the method that can directly determine the extent of spinal cord injury and optimize the best treatment for the injury.Methods After the exposure of the L2-3spinal cord of each rat,0.5% bupivacaine was injected,and the changes in behavior and morphology were evaluated.The behavior changes of each rat′s hind limb and the histopathological changes of spinal cord neurons and the surrounding were observed and recorded to provide a evaluation of the degree of SCI.Results The spinal cord injury in rats of bupivacaine group was more serious compared with that of control group,the BBB score of postoperative rats in bupivacaine group was lower than that of control group,and the pathological HE staining of spinal cord neurons in bupivacaine group appeared empty degeneration and liquefaction necrosis.Conclusion The model of rats that received spinal needle puncture and injected with bupivacaine has a more stable and controllable effects on spinal cord injury.

Local anesthetics;Spinal cord injury;Combined spinal and epidural anesthesia;Animal models

2014-11-30

1.辽宁省肿瘤医院麻醉科，沈阳 110042；2.中国医科大学附属盛京医院a.麻醉科，b.运动医学科，沈阳 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201508003