氨基酸对头霉素C生物合成的影响

李梦茜 张振旺

（河池学院化学与生物工程学院，广西 宜州 5463000）

头霉素C是头霉素类的一种，属ß-内酰胺类抗生素。头霉素以其对 ß-内酰胺酶（包括青霉素酶和头孢菌素酶）的优良抗性而引人注目，其原因是在其分子结构 C7 位上存在一个甲氧基[1]，由此，其通常作为生产半合成抗生素（头孢替坦、头孢西丁、头孢美唑,替莫西林）的原料药[2,3]。所有自然产生的 ß-内酰胺类抗生素的生物合成都是从三个氨基酸开始的，L-α-氨基己二酸(L-α-aminoadipic acid，α-AAA)，L-半胱氨酸(L-cysteine)和 L-缬氨酸(L-valine)[4]。其中 L-α-氨基己二酸是一个非蛋白质氨基酸，来源于赖氨酸(lysine)的合成途径(真菌)，也可以由赖氨酸的分解产生（放线菌）[5]。

本研究对头霉素C发酵过程中氨基酸添加浓度、添加时间、添加方式等进行研究，证明L-α-氨基己二酸和谷氨酸能够促进产物头霉素C的生物合成，并确定了较好的添加控制工艺。

1 材料和方法

1.1 菌种

放线菌Streptomyces sp.OFR 1022，本实验室保藏。

1.2 培养基

种子培养基(%)：葡萄糖 1，蛋白胨1，酵母提取物0.5，自来水配制。

发酵合成培养基(%)：淀粉5，葡萄糖2，棉籽饼粉4，燕麦粉 1，KH2PO4 0.03，Na2HPO4·12H2O 0.05，MgSO4·7H2O 0.15，pH6.5，自来水配制。各种氨基酸待培养基灭菌后再分别加入。

1.3 培养方法

（1）斜面培养：将保存于牛奶冻干管中的孢子接到茄瓶斜面，37℃恒温培养5d，从中挑一个丰满的菌落转接到另一个斜面，37℃培养5 d。

（2）种子培养：由斜面挖块接种子培养基，28℃，250 r/min摇床培养48 h。

（3）发酵培养：将种子液接入发酵培养基， 接种量10%，28℃，250r/min 摇床培养144 h(每个配方三个平行样)后，终止发酵，取适量发酵液于25 ml离心管中，加入等体积的甲醇，振摇混匀20 min后离心(4000 rpm,10 min)，取上清，微孔滤膜过滤后检测相关参数。

1.4 分析方法

头霉素C含量测定：采用HPLC 法，Waters液相色谱仪,色谱柱：PLATISILTM ODS 5μ，250×4.6mm，流动相：A相为0.1% TFA(H2O)，B相为0.1% TFA(乙腈)流速 1.0 ml/min，检测波长254nm，柱温30℃。

2 实验结果与分析

2.1 不同浓度的氨基酸对头霉素C生物合成的影响

头霉素C发酵开始前，在培养基中预先加入不同量的氨基酸，使其最终浓度分别为0.05% 、0.1% 和0.2%，培养144 h 后测定头霉素C的含量，结果如图1，图2，图3所示。

图1 0.05%氨基酸加量对头霉素C生物合成的影响

图2 0.1%氨基酸加量对头霉素C生物合成的影响

图3 0.2%氨基酸加量对头霉素C生物合成的影响

图示数据表明，在添加的氨基酸中，赖氨酸，脯氨酸，L-a-氨基己二酸，谷氨酸，可较大程度地提高头霉素C的生物合成，尤其添加0.1%的L-a-氨基己二酸时，头霉素C的产量比对照提高了65.3% 。其余的氨基酸对头霉素C的生物合成无明显刺激作用，其中DL-蛋氨酸和L-蛋氨酸反而抑制头霉素C的生物合成，这与Kaglival[6]报道的实验结果较为一致。

2.2 氨基酸添加方式对头霉素C生物合成的影响

上述实验证实，在培养基中预先加入浓度为0.1%的脯氨酸，L-a-氨基己二酸，谷氨酸可显著地促进头霉素 C的生物合成。根据经验预测，如果在发酵过程中采用中间补料的方式，可能会有更好的效果。因此，本实验又设计了下列两种方式来研究添加时机与组合添加对头霉素 C生物合成的影响。由于谷氨酸钠为谷氨酸的钠盐，且价格相对低廉，在接下来的试验中同时添加了味素（99.9%的谷氨酸钠）。

2.2.1 不同培养时间补入氨基酸对头霉素C产量的影响

头霉素C的分子结构与母核前体L-a-氨基己二酸呈1∶1的摩尔对应关系，假如菌体对前体的利用率能达到 80%，那么只需补入浓度为0.2%的前体，产物头霉素C的产量即可达到较高单位(计算过程略)。前面实验结果(Fig.1，Fig.2和Fig.3)表明，当氨基酸加量达到0.1% 时就能取得较好的效果，从而提示对照培养基成分中本来就含有一定量的氨基酸。那么我们就选取浓度为0.1%的氨基酸加量，分别在0 h、48 h和72 h进行补料实验，培养144 h后测定头霉素C效价，结果见图4。

图4 氨基酸补加时间对头霉素C生物合成的影响

2.2.2 氨基酸组合添加对头霉素C生物合成的影响

由以上实验结果可知脯氨酸，谷氨酸和 α-氨基己二酸在浓度为0.1%，0 h添加最有利于头霉素C的生物合成，以此为基础，我们考察了三种氨基酸的组合作用。因此选取组合后浓度为0.1%，0 h时将三者组合添加，实验结果如图5 所示，由结果可知，三种氨基酸的组合作用不显著。

图5 氨基酸组合添加对头霉素C生物合成的影响

2.2.3 前体组合添加对头霉素C生物合成的影响

由于L-α-氨基己二酸（α-AAA), L-半胱氨酸（L-Cys）和L-缬氨酸（L-Val）为头霉素 C生物合成的前体，2.1试验已证实单独添加L-Cys 和L-Val并不能提高头霉素C的产量，但是，三者的组合添加或许会对产素有一定的帮助，因此选取组合后的浓度为0.1%，0 h时将三者组合添加，实验结果如图6 所示，由结果可知，三种前体的组合作用并不明显。

图6 前体组合添加对头霉素C生物合成的影响

在前期研究的基础上，综合上述研究结果我们获得了发酵生产头霉素C的较优的培养基配方(%)：淀粉5，葡萄糖2，棉籽饼粉 4，燕麦粉 1，KH2PO4 0.03，Na2HPO4·12H2O 0.05,MgSO4·7H2O 0.15，pH6.5，自来水配制，0.1%的 α-氨基己二酸(价格昂贵)或谷氨酸(价格低廉)待培养基灭菌后加入。对优化后的发酵培养基条件进行验证实验，共三批，结果0 h时添加0.1% 的α-氨基己二酸，平均效价为3869.4 µg/ml，比对照(2386.1 µg/ml)高出62.2%。其次为0 h 时添加0.1% 的谷氨酸(或谷氨酸钠)，平均产素效价为3421.6 µg/ml，比对照高出43.4%。

3 讨论

在头霉素C类抗生素的生物合成过程中，异青霉素N(IPN)的合成被认为是限制性因素，它直接关系到抗生素产量的高低。添加脯氨酸，L-a-氨基己二酸，谷氨酸(或谷氨酸钠)能够提高头霉素C的产量，我们不难发现这几种物质的分子结构很相似，脯氨酸水解后变为谷氨酸，谷氨酸化学名称又称为a-氨基戊二酸，他们的作用可能与a-氨基己二酸相似，直接参与异青霉素N(IPN)的合成。参与ß-内酰胺环合成的还有L-半胱氨酸和L-缬氨酸，但试验中两者的添加并未提高头霉素 C的产量，其原因正在研究当中。氨基酸添加时机为0h时对产素的刺激最大，其根本原因可能在于中间补料时对摇瓶的发酵环境造成了不同程度的影响。在合成培养基中加入的不同氨基酸，它们似乎是以各自不同的方式影响头霉素C 的生物合成，这些氨基酸可能具有前体、诱导物和发育调节剂等一种或多种作用而影响头霉素C的合成。

[1]Kamogashira T, Nishida T, Sugawara M, et al. Process for the production of antibiotic Cephamycin C:US,4332891[P].1982-06-01.

[2]Omstead DR,Hunt GH, Buckland BC.Comprehensive biotechnology[M].New Jersey: Pergamon Press,1985.

[3]Goldstein EJC, Citron DM.Annual incidence, epidemiology,and comparative in vitro susceptibilities to cefoxitin,cefotetan,cefmetazole,and ceftizoxime of recent communityacquired isolates of the Bacteroides fragilis J Clin Microbiol[J].1988,(26):2361-2366.

[4]Carla AL, Andre PC,Maria LGCA. Enhancing effect of lysine combined with other compounds on cephamycin C production in Streptomyces clavuligerus. B M C Microbiology[J].2013,(13):296.

[5]Pérez-Llarena FJ, Rodríguez-García A, Enguita FJ, Martín JF,Liras P. The pcd gene encoding piperideine-6- carboxylate dehydrogenase involved in biosynthesis of alpha-aminoadipic acid is located in the cephamycin cluster of Streptomyces clavuligerus. J Bacteriol[J].1998,(180):4753-4756.

[6]Lalit D, Kagliwal S A, Survase R S. Singhal. Sequential optimization of production of cephamycin C using Nocardia lactamdurans: effect of nutritional supplements,metablic precursors and inducers,Curent Trends in Biotechnology pharmacy[J].2011,5(3):1325-1337.