大鼠弥漫性轴索损伤后海马CA1区锥体神经元电活动变化

段吉强，宋锦宁，郝璞珩，马旭东，李丹东，赵永林，郭小叶，赵君杰

(1.西安交通大学医学院第一附属医院神经外科，陕西西安 710061；2.渭南市中心医院神经外科，陕西渭南 714000)

◇专题研究◇

大鼠弥漫性轴索损伤后海马CA1区锥体神经元电活动变化

段吉强1,2，宋锦宁1，郝璞珩1，马旭东1，李丹东1，赵永林1，郭小叶1，赵君杰1

(1.西安交通大学医学院第一附属医院神经外科，陕西西安 710061；2.渭南市中心医院神经外科，陕西渭南 714000)

目的 观察弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)后大鼠海马CA1区锥体细胞自发放电的特征，揭示DAI对大鼠海马CAl区锥体神经元兴奋性的影响。方法 雄性健康成年SD大鼠30只，随机分为正常对照组及DAI后6 h组、12 h组、24 h组、72 h组。采用玻璃微电极细胞外记录的方法记录海马神经元的放电活动，每只动物记录2个单位放电。分析比较各组各个单位放电的放电类型、放电频率等差异。结果 ①DAI后各组与正常组大鼠海马CA1区锥体细胞观察到3种类型放电，即不规则放电、规则放电和簇式放电。在放电类型上各组差异无统计学意义。②比较各组的12个单位放电的平均放电频率、平均ISI可得出DAI后12 h组的平均放电频率低于其他组，差异有统计学意义；其他组比较差异则无统计学意义。③比较各组簇式放电的簇内ISI：DAI后12 h组最小，其次是24 h组、72 h 组，6 h组与正常组最大且差异无统计学意义。结论 DAI对大鼠海马CAl区锥体神经元兴奋性具有明显影响，并且呈不同放电类型的动态变化。

颅脑损伤；弥漫性轴索损伤；簇式放电；细胞外放电；椎体神经元

弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)在原发性颅脑损伤中很常见，主要特征为胼胝体、脑干等部位的局灶性病变以及脑白质广泛性的轴索损伤，患者通常表现为伤情危重，治疗困难，预后差[1]。但DAI后的病理机制目前仍然不十分清楚。近年来，人们开始关注脑外伤后中枢神经系统突触电活动，研究发现创伤性脑损伤改变了海马局部存活的神经元的兴奋性和抑制性神经递质的细微平衡，破坏了突触电位的正常功能[2]，创伤可以极大增加兴奋性和抑制性突触活动，损伤的一小部分神经元细胞产生动作电位，这些动作电位传播开去导致未损伤区神经元发生高波幅放电。因此，机械性脑损伤立即导致超出损伤部位的组织功能改变[3]。在通常条件下海马CA1的锥体细胞都是规律放电细胞[4]，但在创伤状态下却被转变为激发放电细胞，微电极记录的放电形式主要为簇式(爆发式)放电。研究证明在离体状态下，全细胞膜片钳记录分析簇式放电的离子流本质为Ni2+敏感性Ca2+电流的增加，T型钙电流浓度对神经元放电模式改变起重要作用[5]。目前，研究还主要集中在离体模式下对脑片或原代培养神经元细胞进行膜片钳研究，而本实验拟研究在体情况下DAI损伤后海马CA1锥体细胞电生理变化情况，以揭示DAI对大鼠海马CAl区锥体神经元兴奋性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康成年SD大鼠30只，体质量220～280 g之间。在标准环境下饲养，室温20～25 ℃，24 h昼夜循环光照，自由摄食饮水，饲养1周后进行实验。分组：动物编号后，采用随机数字表法进行随机分组，共分为5组：正常对照组及DAI后6 h 组、12 h组、24 h组、72 h组，每组6只。所用动物均购于西安交通大学医学院实验动物中心。

1.2 动物模型的建立 采用刘晓斌等[6]的大鼠头颅瞬间旋转损伤装置，制作大鼠头颅DAI模型。模型建立后验证DAI模型是否成功：选取DAI后24 h组和正常组行脑组织石蜡切片镀银染色，光镜下观察神经轴突形态并进行比对。

1.3 麻醉、手术和生命体征监测 采用1 g/kg的250 g/L乌拉坦进行腹腔麻醉。麻醉满意后头顶部剪毛(剔除范围大于前后囟)，将大鼠仰卧位固定于木板上，行气管插管和颈静脉插管。颈静脉插管接含100 g/L苯巴比妥钠溶液的注射器，为减少动物活动对记录电极的影响，可根据麻醉深度酌情加量5 mg/(kg·h)。将大鼠俯卧位放置于大鼠脑立体定位仪上，下垫体温毯(调至恒温37 ℃)，整个实验过程中监测大鼠的直肠温度，维持在(37±0.5)℃。

1.4 记录海马神经元放电 采用玻璃微电极细胞外记录的方法记录海马神经元的放电活动，电极尖端直径1～2 μm，阻抗10～20 MΩ，电极充灌含0.5 mmol/L氯化钠溶液。确定海马CA1区的位置为前囟后3.0～4.5 mm，中线旁开2 mm，脑组织表面下2～3.2 mm。微电极推进器将玻璃微电极尖端对准骨窗缓慢向下降，当电极尖端接触脑表面，推进器深度值归零，当深度值显示为2 mm时以10 μm每脉冲的速度向下寻找神经元放电；当出现放电时，上下微调深度值，当调整的放电幅值较大时，固定深度值，观察2～3 min，如放电较稳定，开始记录神经元放电，持续20 min。同样方法记录第2个放电。放电记录完毕后，将玻璃微电极退出。将微量注射器(吸入2 g/L滂胺天蓝溶液约0.15 mL)接在微电极推进器上，下降至原玻璃微电极的深度值，推注注射器内滂胺天蓝，推注完后停留约3 min，再将注射器退出。观察和分析30只大鼠海马CA1区锥体神经元放电，每只大鼠记录了2个神经元放电，总共是60个神经元放电(单位放电)。每个神经元放电记录时间为20 min，用Clampfit 10.0软件检测出放电峰的瞬时频率(instant frequency, IF)和峰峰时间间隔(interspike interval, ISI)，计算出各组神经元平均放电瞬时频率(mean of IF, MIF)、平均放电峰峰时间间隔(mean of ISI, MISI)，统计各组各个单位神经元放电的ISI。

1.5 标本取材及处理 放电实验记录结束后，对电极尖端位置进行组织学鉴定。用300 mL、37 ℃的生理盐水对大鼠进行左心室灌流，直至大鼠眼球颜色发白，换成40 g/L多聚甲醛溶液300 mL灌注，灌注时间大于30 min。灌注成功后断头开颅取脑，以记录点为中心，在其前后2 mm处以冠状面切除两端，保留中间部分。取脑后固定4 h，再置于200 g/L蔗糖溶液中过夜，待组织块沉底或悬浮状态时，行连续冠状冰冻切片，片厚40 μm，进行尼氏(Nissl)染色，以确定记录点的位置。当标识点在海马CA1区锥体层时将数据保留，否则补做该组数据。CA1区位置的确定根据Paxinos编写的《大鼠脑立体定位图谱》给定的坐标标注。CA1区的位置为前囟后3.0～4.5 mm，中线旁开2 mm，脑组织表面下2～3.2 mm。

2 结 果

2.1 大鼠的一般情况 DAI后大鼠均出现不同程度的原发性昏迷，表现为自主活动消失、刺痛反应差或无、瞳孔对光反应减弱，持续时间1 min～1 h不等。昏迷清醒后(自主复正体位、瞳孔对光反应恢复、刺痛反应恢复)表现为：不同程度的反应性下降，四肢活动迟缓、行走不稳，持续1～2 h。正常组大鼠麻醉清醒后，生命体征正常，四肢活动敏捷，出现探索表现。

2.2 脑组织标本的病理学观察 选取DAI后24 h组和正常组海马上部大脑皮质区脑组织行石蜡切片镀银染色，光镜下观察神经轴突形态：正常组大鼠神经元胞膜染色适中，轴突形态完整、伸直；DAI后24 h可见神经元细胞膜固缩深染，神经轴突呈分段状，“轴索球”形成，轴索球之间轴突直径变小，甚至断裂。

2.3 各组的MIF及MISI的比较 正常组的MIF高于DAI后各组。正常组与DAI后12 h组MIF差异有统计学意义(P<0.05)；与DAI后其他时间组比较差异无统计学意义(P>0.05)；DAI后各组间MIF比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

正常组MISI低于DAI后各组。正常组与DAI后12 h组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；正常组与其他DAI组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；DAI各组间进行MISI比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

2.4 各组放电的类型 共观察到海马CA1区锥体层神经元自发放电的类型主要有3种特征：分别为不规则放电、单波规则放电和簇式放电型。

不规则放电：放电信号单位出现的频率及放电ISI不是很稳定，单个发放与阵发夹杂进行；ISI的频数分布较分散，各组段频数无集中趋势(图1)。

表1 各组平均放电频率(MIF)及平均放电峰峰间期(MISI)

Tab.1 Mean interspike frequency and mean of interspike interval in each group

组别神经元数量MIF(Hz)MISI(ms)正常组1267.64±14.08182.44±68.31DAI后6h1239.73±9.37278.33±75.64DAI后12h1225.28±5.90*430.81±120.24*DAI后24h1242.64±11.59263.19±121.86DAI后72h1236.60±8.30213.25±99.68

与正常组比较，*P<0.05。

图1 神经元不规则放电

Fig.1 Irregular discharge of neurons

A：玻璃微电极细胞外记录的海马神经元放电活动；B：神经元规则放电峰峰时间间隔(ISI)频数分布(组距=10 ms)。

单波规则放电：放电信号单位出现的频率、幅度及放电ISI都比较稳定，ISI的频数分布较集中，大致呈钟形分布，ISI平均值为186.56 ms，标准差为68.04 ms(图2)。

神经元簇式放电：发放特点有明显的周期性且呈簇式发放，每串的放电为2～20个波形，不同神经元簇出现的周期不尽相同，从几十微秒到数秒不等，每个周期内可明显地区分放电期和静息期，放电期的总脉冲数没有一定规律。簇式放电的ISI的频数分布较分散，ISI主要集中于0～50 ms，另外在500～2 500 ms区间大致呈钟形分布(图3)。

2.5 各组大鼠神经元放电类型构成比 正常组、DAI后6 h组、12 h组、24 h组、72 h组神经元放电表现均为3种放电类型，实验各组放电类型构成比比较，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

图2 神经元规则放电

Fig.2 Regular discharge of neurons

A：玻璃微电极细胞外记录的海马神经元放电活动；B：神经元规则放电峰峰时间间隔(ISI)频数分布(组距=10 ms)。

图3 神经元簇式放电

Fig.3 Burst discharge of neurons

A：玻璃微电极细胞外记录的海马神经元放电活动；B：神经元簇式放电峰峰时间间隔(ISI)频数分布(组距=10 ms)。

2.6 各组簇式放电的形式及簇内ISI的平均值比较 各组簇内ISI均值单因素方差分析两两比较的结果为：DAI后12 h组、24 h组、72 h组与正常组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)；DAI后6 h组、72 h组与DAI后12 h组相比较，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

表2 各组大鼠神经元放电形式构成比较

Tab.2 Constituent ratio of rat neuron discharge types in each group

[n(%)]

表3 各组簇内峰峰时间间隔(ISI)均值统计

Tab.3 Mean interspike interval (ISI) of burst discharge in each group

组别总簇数(n)各组簇内ISI正常组71360.59±18.32DAI后6h组48758.57±22.67DAI后12h组36318.89±5.79*#△DAI后24h组24126.21±15.07*DAI后72h组37633.00±9.23*

与正常组比较，*P<0.05；与DAI后6 h组比较，#P<0.05；与DAI后72 h组比较，△P<0.05。

3 讨 论

神经元的自发簇式放电是神经通讯的一种形式，它的簇周期、频率，簇内频率及簇内放电串数都是通讯的编码信号，其中一个重要方面就是时间编码，时间参数运载着丰富的传递信息，这种信息传递可能由ISI的尺度变化而表达。对培养的神经元进行电生理研究发现，随着培养时间的延长，突触连接不断增加，神经元网络逐渐复杂和成熟，其自发放电的模式由零星、孤立的形式向簇式放电并进而向更复杂的交替模式转化。神经元之间建立的广泛突触联系并通过这些联系进行化学和电信息交流，这可促进自发簇式放电活动的活跃，而簇式放电的活跃能反过来加强突触连接，促进神经元之间的信息传递[7]。

簇式放电发生需同时满足2个条件：一是足够水平的兴奋性，二是发放之前的一段时间静息。本实验中观察到DAI后12 h组的各个单位放电的平均放电频率增加，分析其原因，由于DAI后12 h不仅神经元的兴奋性增加，而且轴突损伤可激活Ca2+浓度快速升高，造成突触前膜去极化，当冲动传入时，突触前膜释放神经递质减少，这样突触后神经元将有一段时间静息，这两方面作用的结果导致了DAI后12 h组簇式放电增多。另外，损伤神经产生自发放电模式改变的原因也可能与损伤区中终球膜离子通透性发生了变化有关，因为DAI后其离子通道数量、类型均与正常轴突有很大差异。

有关DAI后自发簇式放电降低的机制，本研究发现DAI后12 h组大鼠的海马CA1区锥体层神经元的放电频率低于其他各组，分析其原因，可能与下列因素有关：①由于DAI后12 h可见脑干、大脑皮髓质交界区、胼胝体等部位轴突肿胀、断裂，轴索球形成[6]，虽没有直接证据表明perforant投射纤维损伤，但我们的前期研究[8]证实，DAI后脑组织中微血管有微血栓形成，从病理学角度分析，脑微血管堵塞是脑损伤后主要病理学改变之一，这种微循环障碍造成的脑缺血可导致继发性神经组织损害[9]；另外，海马结构为脉络膜前动脉终末血管供血[10]，极易引起缺血损伤。故推测这一现象的出现可能与perforant通路的损伤，海马门部传入的刺激信号到达CA1区减少有关。②DAI损伤后轴突Ca2+浓度快速升高，延长了神经元的不应期使兴奋性降低。③schaffer侧支也可传递海马门部的信号跨过CA3区到CA1区。ABEGG等[3]发现，培养的海马脑片中将CA3区锥体细胞成熟的轴突被切断后，又会生成新的轴突侧枝，这提示机械损伤有可能诱导CAI区schaffer侧支轴突侧支的产生，有更多的侧支与CAl的神经元形成更多的突触联系。④谷氨酸能使突触前结构发生改变[11]。这种改变使得与CA1区神经元相接的突触前膜因兴奋性毒性作用暂时或永久失去了信号传递的能力。但是，这还需要进一步实验，研究其是否会影响突触后锥体神经元兴奋性改变。

总之，DAI后不仅轴突发生了肿胀、断裂，轴索球形成，而且DAI对神经元兴奋性具有明显影响，并且呈不同放电类型的动态变化，进一步揭示这些电生理变化的规律及其发生机制，将对深入认识DAI的病理生理变化具有重要意义。

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(编辑 国 荣)

Changes in the electrical activity of hippocampal CAl pyramidal neurons in rats with diffuse axonal injury

DUAN Ji-qiang1,2, SONG Jin-ning1, HAO Pu-heng1, MA Xu-dong1, LI Dan-dong1, ZHAO Yong-lin1, GUO Xiao-ye1, ZHAO Jun-jie1

(1. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 2. Department of Neurosurgery, Weinan Central Hospital, Weinan 714000, China)

Objective To study the excitatory feature of hippocampal CAl pyramidal neurons affected by traumatic brain injury by investigating the spontaneous discharge characteristics of hippocampal CA1 pyramidal cells after diffuse axonal injury (DAI). Methods Thirty healthy male SD rats were randomly divided into 5 groups: the control group, the group of 6 h after DAI, the group of 12 h after DAI, the group of 24 h after DAI, and the group of 72 h after DAI. Glass microelectrode was used to record extracellular hippocampal neurons discharge. Two unit discharges were recorded for each animal. The differences in unit discharge type and discharge frequency were analyzed among the groups. Results ① The three types of discharges were observed in the hippocampal CA1 pyramidal cells from the normal and DAI rats as irregular discharge, regular discharge and burst discharge. There was no difference in the discharge among the groups. ② Twelve-unit discharges were recorded in each group. The mean frequency and the average ISI of 12 hours in the DAI group significantly differed from those of the other groups. ③ For the cluster ISI, the group of 12 h after DAI had the smallest ISI, followed by the groups of 24 h and 72 h after DAI. However, no significant difference in cluster ISI was found between the group of 6 h after DAI and the control group. Conclusion The electrical activity of hippocampal CAl pyramidal neurons is obviously affected by diffuse axonal injury, which makes dynamic changes with various kinds of discharge.

brain injury; diffuse axonal injury; burst discharge; extracellular discharge; pyramidal neurons

2014-04-21

2014-08-14

国家自然科学基金资助项目(No.30471774)；教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目(No.NCET-05-0831)；陕西省自然科学基金资助项目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774), the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831), and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋锦宁. E-mail: jinnings@126.com

R651.1+5

A

10.7652/jdyxb201501012

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20141119.1709.019.html(2014-11-19)