不同活血化瘀方对扩张型心肌病小鼠心肌细胞的作用及对NF-κB通路的影响*

王鸣瑞,韩明向

1)安徽中医药大学中西医结合临床学院 合肥 230038　2)安徽中医药大学第一附属医院老年科 合肥 230031



不同活血化瘀方对扩张型心肌病小鼠心肌细胞的作用及对NF-κB通路的影响*

王鸣瑞1),韩明向2)#

1)安徽中医药大学中西医结合临床学院 合肥 2300382)安徽中医药大学第一附属医院老年科 合肥 230031

关键词活血化瘀；扩张型心肌病；NF-κB通路；小鼠

摘要目的：研究不同活血化瘀方对扩张型心肌病小鼠心肌细胞的作用及对NF-κB通路的影响。方法：240只BALB/c小鼠随机分为方剂A组、方剂B组、模型组和空白组，每组60只。前3组采用柯萨奇B3m病毒制作实验室病毒性扩张型心肌病模型，方剂A组、方剂B组小鼠造模后分别以方剂A和方剂B灌胃治疗，模型组和空白组小鼠均灌注等量的纯水，1次/d，连续5周。比较各组小鼠的心脏质量指数。运用HE和VG染色法观察各组小鼠心肌细胞的病理学改变。采用TUNEL法检测小鼠心肌细胞的凋亡情况。采取RT-PCR法和免疫组化法检测各组小鼠心肌细胞NF-κB mRNA和蛋白的表达情况。结果：方剂A组、方剂B组和模型组小鼠心脏质量指数、心肌胶原容积分数、凋亡心肌细胞数及NF-κB mRNA和蛋白的表达均高于空白组(P<0.05)；方剂A组和方剂B组小鼠的上述5个指标均低于模型组(P<0.05)；方剂A组上述5个指标均低于方剂B组(P<0.05)。结论：不同活血化瘀方对扩张型心肌病小鼠心肌细胞的改善作用和对NF-κB通路的影响有差异。

AbstractAim: To study the effect of different promoting blood circulation to remove blood stasis prescriptions on myocardial cells of mice with dilated cardiomyopathy and the effect on the NF-κB pathway.Methods: A total of 240 BALB/c mice were allocated into 4 groups with 60 in each group:group A,group B,model group,and control group.The model of dilated cardiomyopathy was made by B3m virus in the first 3 groups. The model mice in group A and group B were treated by two kinds of activating blood and removing blood stasis decoction. The heart mass index of the mice was compared. The pathological changes of myocardial cells from the mice were observed by HE and VG staining. The apoptosis of myocardial cells was detected by TUNEL. The expressions of NF-κB protein and mRNA were detected by immunohistochemical method and RT-PCR.Results: The heart mass index, myocardial collagen volume fraction, apoptosis of myocardial cells, and expressions of NF-κB protein and mRNA of group A, group B and the model group were higher than the control group(P<0.05). The 5 indexes of group A and group B were lower than those in the model group(P<0.05). And the 5 indexes of group A were lower than those in group B(P<0.05).Conclusion: The effects of different promoting blood circulation to remove blood stasis prescriptions on myocardial cells of mice with dilated cardiomyopathy and the effect on the NF-κB pathway are different.

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)主要临床表现为心腔扩大、心律失常和心力衰竭等[1-2]；其发病机制多与病毒感染和自身免疫有关，慢性病毒性心肌炎会导致DCM的发生[3-5]。近年来，DCM的发病率和致死率呈现逐年上升的趋势。当DCM出现心力衰竭症状后，患者的5 a生存率仅为40%[6-7]。NF-κB在病理状态下具有诱发心肌重塑、心肌肥大的作用，与DCM的发生发展有关。目前，DCM主要采取对症治疗、免疫药物治疗、介入治疗、心脏移植和细胞移植等手段，但总体疗效并不乐观[8-9]。中医药在治疗疾病时基于辨证论治的原则，立足于整体，通过多靶点和多途径对患者机体进行整体调节，优于机制单一的化学药物，且患者易于接受。中医药在治疗该病时多从气虚血瘀论治。该研究采取柯萨奇B3m病毒制作病毒性DCM小鼠模型，对模型小鼠采用两种不同的活血化瘀方剂灌胃治疗，观察这两种方剂对DCM的治疗效果及其对NF-κB通路的影响，报道如下。

1材料与方法

1.1材料实验药品:活血化瘀方A(以下简称方剂A)由黄芪、红参、生地、远志、川芎、桔梗、丹参、合欢皮、大青叶、升麻等药物组成。活血化瘀方B(以下简称方剂B)由当归、川芎、熟地、红花、桃仁和白芍组成。方剂A和B均经水提取后制成浸膏，用纯水稀释至每mL悬液含生药4.3 g备用。主要试剂：Trizol RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)，M-MuLV反转录酶(美国NEB公司)，5 U/μL Taq DNA聚合酶(广州东盛生物科技有限公司)；NF-κB p65抗体(A):SC-109抗体(美国DAKO公司)，PV-9001兔超敏免疫组化检测试剂盒(美国Santa Cruz公司)，DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。实验动物：BALB/c小鼠240只，雄性，4周龄左右，购自中国科学院斯莱克实验动物中心(SCXK京2011-0012)。造模用病毒：柯萨奇B3m病毒购自哈尔滨医科大学克山病研究所。购回后于Hela细胞中培养传代，冻融3次后，以2 000 r/min离心，取上清液，Hela细胞中测50%组织感染率为10-7，保存于-70 ℃备用。

1.2实验动物分组与取材BALB/c小鼠常规饲养1周后随机分为方剂A组、方剂B组、模型组和空白组，每组60只。前3组小鼠均于实验开始的第1、8、15、22、36和50 天腹腔注射RPMI 1640稀释的B3m，空白组口服相同剂量生理盐水。造模结束,超声心动图检查显示前3组小鼠左室舒张末径、左室收缩末径均高于空白组；4组均随机选取2只小鼠，处死后病理切片显示小鼠心腔明显扩大，心肌细胞变性、坏死以及出现纤维化，说明造模成功。4组小鼠均于实验开始的第60天后开始灌胃。方剂A组和B组分别灌注由活血化瘀方A和B制备的中药悬液，灌注剂量均为20.5 g/(kg·d)，1次/d，连续5周;模型组和空白组小鼠灌注等量的纯水。5周后，方剂A组、方剂B组、模型组和空白组存活小鼠数量分别为56、51、43和58只。所有存活小鼠经称重后采用颈椎脱臼法处死，经体积分数75%乙醇消毒后，无菌条件下开胸取出心脏，用4 ℃的预冷生理盐水冲洗掉血污，经滤纸吸干后用电子天平称量。心脏质量指数为心脏质量(mg)与体重(kg)的比值。所取心肌组织采用40 g/L的多聚甲醛溶液固定后，经石蜡包埋，切片机连续切片后用于病理学检查。

1.3各组小鼠心肌细胞的病理学检查采用HE染色法观察各组小鼠心肌细胞的病理学改变，采用VG染色法观察小鼠心肌细胞间质胶原纤维的变化。在脑梗死区以及梗死周围区域，于100倍光镜下，每张切片选择8~10个视野，采用多媒体彩色病理图像分析仪计算单个视野中胶原组织占心肌面积的百分比，即心肌胶原容积分数。

1.4小鼠心肌细胞凋亡检测采用TUNEL法检测小鼠心肌细胞的凋亡情况。组织切片脱蜡脱水后，经蛋白酶K孵育30 min，PBS洗片，以含体积分数0.3%过氧化氢的甲醇溶液孵育30 min，PBS淋洗，加入TUNEL液孵育60 min，PBS淋洗，苏木精复染，封片。以细胞核棕黄色染色为阳性。在400倍光镜下选取8~10个视野，计数阳性细胞。

1.5小鼠心肌细胞NF-κB mRNA表达的检测采用RT-PCR法。用Trizol法提取小鼠心肌细胞RNA，并逆转录成cDNA。具体实验操作按照RT-PCR试剂盒的说明进行。NF-κB上游引物序列5’-ATCAGACTGGGCTTAAGCCTAC-3’，下游引物序列5’-TAGCCGCTATCGCAGATGGCTGTGC-3’； β-actin上游引物序列5’-TGATGCAGTTGGTCGCTGATG GCA-3’，下游引物序列5’-CTAGCGCGCTAT GTCGACATTGCATG-3’(上海吉凯基因化学技术有限公司设计并合成)。PCR反应体系为50 μL。94 ℃下先预变性4 min；然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，30个循环；最后72 ℃下延伸10 min。结果判定：取10 μL RT-PCR产物进行电泳，使用凝胶扫描系统扫描，以目的基因与β-actin基因光密度的比值表示该目的基因mRNA的表达水平。

1.6小鼠心肌细胞NF-κB蛋白表达的检测采用免疫组化法检测。4 μm组织切片常规脱蜡后，60 ℃烤箱过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；抗原修复后以PBS淋洗；滴加过氧化物酶，室温孵育10 min；滴加NF-κB一抗(按1500稀释)(阴性对照采用PBS作为一抗)，室温下孵育30 min，PBS淋洗；分两步滴加二抗PV9001；DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱色，光学显微镜下观察。阳性细胞为细胞质染为棕黄色或者黄色。采用光密度值表示NF-κB蛋白的表达水平。

1.7统计学处理应用SPSS 17.0处理数据。采用单因素方差分析比较4组小鼠的心脏质量指数、心肌胶原容积分数和心肌细胞凋亡情况以及NF-κB mRNA及蛋白的表达水平，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1各组小鼠心脏质量指数、心肌组织病理学改变及心肌细胞凋亡情况比较结果见图1、表1。HE染色结果(图1)显示，空白组小鼠心肌纤维整齐，无间质血管改变，心肌细胞未见变性和坏死；模型组小鼠心肌纤维紊乱，血管充血出血，心肌细胞呈肥大空泡状，间质纤维化明显；方剂B组心肌纤维较紊乱，血管充血出血，心肌细胞空泡变性，间质轻度纤维化；方剂A组心肌纤维轻微紊乱无断裂，间质轻微纤维化。VG染色结果(图1)显示，空白组小鼠心肌细胞偶见染成红色的胶原纤维；模型组小鼠可见坏死心肌周围存在大量胶原纤维；方剂B组小鼠坏死心肌周围可见较多胶原纤维；方剂A组小鼠坏死心肌周围只有少量胶原纤维聚集。由表1可知，方剂A组、方剂B组和模型组小鼠心脏质量指数、心肌胶原容积分数、心肌细胞凋亡均高于空白组；方剂A组和方剂B组上述3指标均低于模型组；方剂A组上述3指标均低于方剂B组。

图1　各组小鼠心肌组织HE染色和VG染色结果(×400)

表1　各组小鼠心脏质量指数、

*：与空白组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与方剂A组比较，P<0.05。

2.2各组小鼠心肌细胞NF-κB mRNA和蛋白的表达比较见表2、图2。由表2可知，方剂A组、方剂B组和模型组小鼠NF-κB mRNA和蛋白的表达均高于空白组；方剂A组和方剂B组小鼠NF-κB mRNA和蛋白的表达均低于模型组，且方剂A组低于方剂B组。

表2　各组小鼠心肌细胞NF-κB mRNA和蛋白的表达

*：与空白组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与方剂A组比较，P<0.05。

图2　各组小鼠心肌细胞NF-κB蛋白的表达(PV,×400)

3讨论

有研究[10-11]表明，正常心脏组织细胞外基质的合成和降解存在着一种平衡，当平衡破坏时，心脏的形态和功能就会受到影响。心脏胶原的合成是一个动态过程，合成增加或降解减弱都会造成胶原的累积，最终导致心室重塑[12-13]。该研究发现模型组小鼠的心脏质量指数和心肌胶原容积分数均高于空白组，心肌纤维紊乱、撕裂，间质纤维化；说明DCM会促使心肌胶原纤维增生，最终导致心肌重塑。与模型组相比，经灌注方剂A或方剂B治疗后，小鼠的心脏质量指数和心肌胶原容积分数均有降低，且方剂A的疗效优于方剂B。

DCM的发病多与病毒感染有关。有研究[14-15]认为，病毒感染心肌细胞会诱导心肌细胞凋亡蛋白的表达，使得心肌细胞不断丢失，最终发展为DCM。该研究发现模型组小鼠心肌细胞凋亡高于空白组，说明病毒感染会诱导心肌细胞凋亡，与已有研究[16]一致。与模型组相比，经灌注方剂A或方剂B治疗后，小鼠的心肌细胞凋亡均有降低，且方剂A的疗效要优于方剂B。

有文献[17-18]报道，NF-κB会导致神经内分泌细胞因子系统的过度激活，诱发心肌重塑，诱导心肌肥大，诱导心肌细胞发生凋亡。该研究发现，模型组小鼠心肌细胞NF-κB mRNA和蛋白的表达均高于空白组，与上述报道[17-18]一致。经灌注方剂A或方剂B治疗后，小鼠心肌细胞NF-κB mRNA和蛋白的表达均降低，且方剂A的疗效要优于方剂B。有研究[19]表明，DCM是以气虚为本，血瘀、痰浊为标。观方剂A用药，方中黄芪为补气之首，常用于气虚衰弱，补气升阳，常与方中升麻配伍，再配以大补元气的红参，以达补气之目的。所谓“气为血之帅”“气滞则血瘀”，方中多种补气药，能有效改善实验小鼠气虚病症。此外，方剂A在补气的同时，佐以生地、川芎、丹参、大青叶、合欢皮等活血药和远志、桔梗等祛痰药。再观方剂B用药，是养血、补血的经典药方，桃红四物汤。该方以祛瘀为主，再辅以养血、行气。方中以强劲的桃仁、红花为主，力主活血化瘀；以甘温熟地、当归养血调经；芍药养血和营，川芎活血行气。方剂A中，以大补元气的黄芪、红参为主，力主补气，再佐以多种活血化瘀、祛痰药，以达标本兼治的目的，而方剂B重在强调活血化瘀的对症治疗，可以改善疾病症状，但不能完全消除病因。所以，方剂A的治疗效果要优于方剂B，这与实验所得的结果相一致。

总之，临床上对于DCM的治疗，可采取补气加活血化瘀的方法，以达标本兼治的目的。

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*国家自然科学基金资助项目81071724；河南省基础与前沿基金资助项目142300413224

Effects of different activating blood and removing stasis prescriptions on myocardial cells of mice with dilated cardiomyopathy and NF-κB pathway

WANGMingrui1)，HANMingxiang2)

1)IntegrativeMedicineClinicalSchool,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei2300382)DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospital，AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230031

Key wordsactivating blood and removing blood stasis;dilated cardiomyopathy;NF-κB pathway；mouse

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.019

中图分类号Q95-3

通信作者#，男，1940年11月生，教授，主任医师，研究方向：中医内科学老年病学方向，E-mail：HMX401125@sina.com