利斯的明中间体含量及ee值的RP-HPLC法测定*

李永红，周方方, 付路平，刘宏民#

1)郑州大学新药研究开发中心 郑州 450001　2)郑州大学药学院 郑州 450001



利斯的明中间体含量及ee值的RP-HPLC法测定*

李永红1,2)，周方方2), 付路平2)，刘宏民1,2)#

1)郑州大学新药研究开发中心 郑州 4500012)郑州大学药学院 郑州 450001

关键词利斯的明；手性药物中间体；ee值

摘要目的：建立RP-HPLC法测定生物转化液中利斯的明中间体含量及ee值的方法。方法：以Lux 3u Cellulose-1为手性分离柱，以正己烷异丙醇(VV=92.57.5)为流动相，检测波长217 nm，进样量20 μL。结果：中间体能够完全分离，在测定中间体含量的同时能够测定样品的ee值。结论：该方法准确、灵敏、精密度良好，适合生物转化液中利斯的明中间体含量及ee值的测定。

AbstractAim: To establish a RP-HPLC method to determine the ee values and content of rivastigmine intermediates in bioconversion broth.Methods: The determination was performed on a Lux 3u Cellulose-1 column with a 92.57.5(VV) mixture of n-hexane and isopropanol alcohol as mobile phase, determination wavelength of 217 nm and injection volume of 20 μL.Results: The two intermediates were completely separated. The ee value could be determined as well as the determination of the content of the intermediates.Conclusion: The method is accurate and sensitive with high precision.It is suitable for the determination of the ee values and content of rivastigmine intermediates in bioconversion broth.

利斯的明可以选择性地在大脑区域内作用并有较长持续时间的活性，是氨基甲酸酯类乙酰胆碱酯酶抑制剂[1-2]。Enz等[3]通过HPLC-MS的方法测定了利斯的明的代谢产物在大鼠脑和血浆中的浓度。Pommier等[4]开创了采用GC-MS测定人体血浆样品中利斯的明浓度的方法。该研究建立了利用RP-HPLC测定生物转化液中利斯的明中间体含量及ee值的方法。该方法快速、简单，且不受杂质的影响，报道如下。

1材料与方法

1.1仪器型号与试剂HYG-Ⅱa 型自动摇瓶柜(上海欣蕊自动化设备有限公司)，R-1005旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)，Waters 1525高效液相色谱仪，色谱柱为Lux 3u Cellulose-1柱(4.6 mm×250 mm，美国Phenomenex公司)。菌种来源：郑州大学药学院筛选并保藏的一株能产生立体选择性酯酶的菌种。正己烷为色谱纯(天津康科德科技有限公司)，其他试剂为分析纯。

参考文献1.2样品的拆分原理及制备[5-8]，作者筛选到一株能产生立体选择性酯酶的菌株，用脂肪酶Novozym453转化化合物2，以乙酸异丙烯酯为酰基供给体，得到中间体(R)-1和(S)-2。见图1。

图1　化合物2的转化

具体制备步骤如下：将菌种转接到培养基，于28 ℃、220 r/min条件下培养48 h后加入底物，同等条件下转化12 h得到转化液。合并用相同体积的乙酸乙酯萃取转化液3次后的有机相；经无水Na2SO4干燥后，旋转蒸发仪蒸干，用相应的流动相溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过后用于测定。

1.3色谱条件流动相为V正己烷V异丙醇=92.57.5，流速0.8 mL/min，检测波长为217 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。

1.4色谱峰的归属转化12 h后，分析转化底物和产物的HPLC图谱，并以此样品图谱与实验室保藏菌种转化产品的HPLC图谱对比，进行色谱峰的归属。

1.5方法学分析

1.5.1标准曲线的绘制[9-10]准确称量自制的化合物2[(R)-2为化合物2的R型异构体]和化合物1各1.0 g，加异丙醇溶解并定容至100 mL，配成2种化合物质量浓度均为10 g/L的混合标准样品。取适量上述混合样品，用流动相稀释为质量浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 g/L的标准溶液，按1.3提供的条件测定并进行线性回归分析，求得标准曲线。

1.5.2 精密度实验按照1.3方法，取一份转化液进行测定，重复5次，记录其峰面积并计算RSD值。

1.5.3加标回收率在转化液中加入不同质量浓度的混合标准样品，按1.3方法测定，计算加标回收率。

1.5.4样品ee值的计算通过样品2个异构体的峰面积来计算ee值，ee=(R异构体峰-S异构体峰)/(S异构体峰+R异构体峰)×100%。

2结果

2.1化合物的分离效果用上述液相条件，在利斯的明中间体拆分过程中，化合物2和化合物1的分离效果比较理想。各个中间体名称、结构、色谱图和分离结果见图2。左：化合物2和化合物1混合物的HPLC图谱；中：消旋的化合物2转化12 h后转化为(S)-2、(R)-1的HPLC图谱；右：化合物2的HPLC图谱。

图2　相关中间体的结构

从图2可以看出，化合物1和化合物2可以被完全拆分，HPLC图谱基线平稳，转化液经处理后基本没有杂质。通过化合物1和化合物2混合物的HPLC谱图、化合物2的HPLC图谱及消旋化合物2转化12 h后的HPLC图谱结果对比分析可知，新出现的峰为化合物(R)-1的峰，转化12 h后，化合物(S)-2的峰面积基本没变，而化合物(R)-2的峰面积有所减少，且没有(S)-1的峰出现。化合物1的(R)-异构体和(S)-异构体保留时间分别为(10.334±0.300) min和(12.037±0.300) min，化合物2的(S)-异构体和(R)-异构体保留时间分别为(14.618±0.200) min和(17.045±0.300) min，误差在允许范围内。

2.2方法学分析结果2种化合物在0.25~1.25 g/L范围内线性关系良好。化合物2的线性方程为Y=24 472X-74.767，R2=0.999 5，化合物1的线性方程为Y=21 961X+404.98，R2=0.999 3；该方法测定结果的精密度较好，RSD分别为1.190%(n=6)和1.850%(n=6)；化合物(R)-1的ee值为93.22%，化合物(R)-2的ee值为92.22%。化合物2和化合物1的加标回收率分别为98.170%和98.830%。

表1　加样回收实验结果

3讨论

该实验所用的正己烷和异丙醇均为色谱纯且样品中没有过多的杂质，故HPLC谱图基线平稳，色谱峰之间没有重叠，测定结果准确。使用该方法不但使化合物1、2得到了良好的分离，而且各自的2种对映异构体也基本上被分离，在实验过程中不仅可同时测定2种化合物的含量，还可以测定其ee值，有利于对转化过程进行跟踪测定，且灵敏度高。作者利用此分析方法已经对季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)HM988686.1催化利斯的明中间体拆分的转化条件进行优化，利用优化后的条件进行转化，转化速度大大提高。

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*安徽中医药大学2014年自然科学基金资助项目2014zr010

Determination ofeevalues and content of rivastigmine intermediates by RP-HPLC

LIYonghong1,2),ZHOUFangfang2),FULuping2),LIUHongmin1,2)

1)NewDrugResearch&DevelopmentCenter，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500012)DepartmentofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsrivastigmine; chiral drug intermediate; ee value

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.018

中图分类号TQ460.7

通信作者#，男，1960年3月生，博士，教授，研究方向：药物化学及糖化学，E-mail：liuhm@zzu.edu.cn