钙网蛋白与肿瘤的相关研究进展

金 明综述，张志伟，罗招阳审校

（南华大学肿瘤研究所，湖南衡阳421001）

钙网蛋白与肿瘤的相关研究进展

金 明综述，张志伟，罗招阳审校

（南华大学肿瘤研究所，湖南衡阳421001）

钙网蛋白； 肿瘤； 信号传导； 肿瘤侵润； 肿瘤转移； 综述

钙网蛋白（CRT）是一种高度保守的内质网伴侣蛋白，参与各种细胞活动过程。1974年，CRT被分离出来，并被鉴定为钙离子结合蛋白。大量研究表明，CRT对不同肿瘤的发展具有重要的影响，且对肿瘤形成和进展的影响可能取决于细胞类型和临床分期[1-3]。本文总结CRT的生物学作用在肿瘤中表达的临床意义和促进肿瘤侵袭、转移的信号通路。

1 CRT的结构与功能

1.1 CRT的结构 人类CRT基因位于第19号染色体，由9个外显子和8内含子构成，其开放性阅读框架长度为1 254 bp，编码由417个氨基酸组成的酸性蛋白质。CRT主要定位于内质网，在内质网内外均具有多种功能[1]。它由N末端可切割的信号序列和1个C末端内质网赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸（KDEL）定位信号组成。CRT的结构预测表明，该蛋白质由3个结构域组成，即N-结构域、P-结构域（高亲和性、低容量）和C-结构域（低亲和性、高容量）[2]。富含脯氨酸的P-结构域包含两组3个重复区域。这些重复的氨基酸序列形成凝集素样分子伴侣结构，该结构使得CRT具有蛋白质折叠功能。此外，CRT的P-结构域也是一个高亲和力和低容量的钙离子结合区[3]。

CRT的 C-末端中有 1个内质网滞留信号序列KDEL，因而这种蛋白质在内质网腔中含量丰富。CRT也在细胞质和细胞表面表达[4]。C-结构域对CRT从E内质网腔易位到细胞质中具有重要作用。进一步的研究还表明，该易位过程是由内质网中钙耗竭所触发的[5]。细胞表面的CRT与巨噬细胞吞噬和细胞的免疫原性相关[6]。CRT作为一种多功能蛋白，可能参与细胞的各种生理和病理过程。

1.2 CRT的生物学功能 在以往的研究中已提出CRT参与细胞的各种生理和病理过程中。CRT在内质网内的2个主要功能是蛋白质分子伴侣和钙稳态调节。此外，非ER的CRT也能调节重要的生物学功能，包括细胞黏附、基因表达和RNA稳定性。

1.2.1 蛋白质分子伴侣 ER是用于合成、折叠和运输分泌蛋白的重要细胞器。这些功能是通过分子伴侣促进蛋白正确的折叠和组装来实现的。最近的研究表明，CRT涉及参与蛋白质合成过程中的质量控制过程，包括整合体、表面受体及转运者[7]。

1.2.2 钙平衡 钙离子主要储存在ER腔，是影响许多细胞过程的一个普遍的信号分子。许多研究表明，钙离子结合分子伴侣影响内ER内钙离子的存储容量[8-9]。CRT被认为是一种细胞内钙离子调节剂，其包含了P-结构域和C-结构域这2个钙离子的结合位点，ER腔中超过50%的钙离子与CRT相关。因此，较高水平的CRT可能导致细胞内钙离子储存的增加。相反，CRT缺失的细胞对钙离子在ER腔中的存储具有较低的容量。另外，CRT的功能异常也与脂肪细胞分化[10]和渗透压下的汉勒循环调节有关[11]。这些研究结果进一步证实了CRT在维持钙稳态中发挥重要作用。

1.2.3 细胞黏附 CRT可能参与细胞黏附的概念是基于通过多种机制对灶性接触的调节[12]。细胞外基质（ECM）分子对于灶性接触的形成很重要。一些研究表明，钙网蛋白水平的改变的影响不同的细胞外基质的细胞黏附[13]。Papp等[14]发现，CRT对细胞的黏附性控制是通过调节纤维连接蛋白表达和基质沉积。CRT的这些效应是通过钙离子依赖性的CRTc-Src活性来调节的。此外，已有研究结果显示，CRT介导的细胞黏附可能是由于CRT与整合素之间的直接相互作用，即通过结合整合素α亚基细胞质KXGFFKR基序[15]。这些研究表明，CRT与细胞的黏合性有着紧密联系，且在调节细胞黏附中发挥着关键作用。

1.2.4 其他 CRT作为反式作用因子，可以调节mRNA的稳定性，且已经发现CRT在细胞外环境中具有一些新的功能，例如，对皮肤伤口愈合的作用及在血液和尿液中可能具有诊断性应用价值。

1.3 CRT表达的调节 人类CRT基因位于第19号染色体，其启动子区域包含多重调节位点。CRT的启动子区包含许多已命名转录因子的结合位点，且这些转录因子中已有许多被认定为CRT表达的重要调节因子。此外，钙耗竭和ER应激被认为是CRT转录的重要激活剂[16]。最近研究还表明，神经生长因子（NGF）在卵巢细胞和神经细胞的分化[17-18]过程中也可上调CRT的表达。这些研究结果表明CRT的表达可参与众多的生理和病理过程。

2 CRT与肿瘤

2.1 CRT在不同肿瘤中表达的临床意义 在各种肿瘤中，CRT表达水平与肿瘤发生之间的相关性已被广泛研究，大多数研究表明，CRT在肿瘤组织中的表达水平显著高于其在正常组织[19]。有研究表明，在胃癌和乳腺癌中，CRT的表达水平与临床分期和淋巴结转移呈正相关[16，20]。此外，CRT表达水平较高的胰腺癌和食管鳞状细胞癌[21]患者生存率非常低。有研究结果显示，CRT表达水平在口腔癌[22]、乳腺导管癌[23]、结直肠癌[24]中呈显著上调。此外，CRT的表达水平不仅在膀胱癌组织中增高[25]，尿中的CRT也被证实可以作为检测膀胱尿路上皮癌的一种有用的生物标志物。钙网蛋白高表达在肿瘤进展中可能发挥着关键作用。另一方面，CRT在卵巢癌进展中的作用尚无定论。与原发肿瘤和实性器官转移相比，在伴恶性胸腔积液的高分化卵巢癌中，CRT的表达随着疾病的进展表达下降[26]。另外，积液中CRT的表达水平可能与化疗更相关，且生存率与CRT的表达是不相关的。更进一步地说，在神经母细胞瘤中CRT的高表达被证明具有更好的预后和组织学分化类型[27]。因此，CRT对肿瘤的形成和进展的影响取决于不同的细胞类型和临床分期。最近，在骨髓增殖性肿瘤（MPN）中检测到了CRT基因的突变[28]。这些CRT的突变，包括52 bp缺失和插入5 bp某些碱基对将导致移码突变[29]。由突变的CRT基因所编码的蛋白缺乏C-末端KDEL域，因此其可能会影响正常钙离子的结合和细胞生长。

2.2 CRT对肿瘤细胞增殖的影响 突变细胞的快速增殖是肿瘤形成的特点。已有许多研究阐明，控制CRT表达水平对不同类型肿瘤细胞的细胞增殖都有重要影响。在胰腺细胞中，CRT过表达增强细胞的生长，而敲低CRT对细胞生长[30]具有相反的效果。此外，在口腔癌细胞中，CRT的消耗引起细胞周期停滞G0/G1期，从而导致其显著抑制生长速率、集落形成的能力。血管内皮生长因子的调节血管生成的作用已有案可稽[31]。因为由肿瘤细胞分泌，血管内皮生长因子结合特异性受体，并激活下游信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），以及可以促进细胞增殖、存活、迁移和血管生成的Ras/胞外信号调节激酶（ERK）[32]。尽管许多研究表明CRT能促进细胞的生长，但仍有研究提出了关于这个问题的不同观点。此外，血管抑制因子是CRT中的1个片段，被认为是一种抗血管生成因子，并可以抑制细胞内皮生长因子（VEGF）诱导的内皮细胞增殖[33]。最近的研究还表明，在神经细胞瘤细胞中CRT可以上调VEGF的表达，抑制细胞增殖，并增强细胞分化[34]。这些结果证明，CRT对细胞增殖的影响可能取决于细胞类型。

2.3 CRT与肿瘤转移 转移是肿瘤进展的重要事件。此机制涉及许多过程，包括细胞黏附、迁移和侵袭。在胃癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌中钙网蛋白过表达有助于肿瘤的转移。对CRT介导的细胞迁移或黏附力的可能机制已有深入研究。其中一个可能的机制是CRT是少数细胞质蛋白之一，可以直接与整合素α亚基相互作用。最近的一项研究发现，在CRT高表达的上皮间质样细胞中，在整合素依赖性的细胞黏附力在纤维连接蛋白上明显受到了影响[35]。

其他机制学说也提出了CRT通过焦点接触依赖性方式来调节细胞黏附和迁移。这个理论得到进一步支持，因为不同水平的CRT的影响ECM的表达。对CRT在小鼠L-成纤维细胞表达的控制，已经对其纤连蛋白的合成产生深远的影响。这些影响可能是由于对c-Src活性的调节。

CRT表达较高的细胞其黏附性增高，这与CRT/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ途径相关。此外，细胞表面的CRT与血小板相互作用，并通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）依赖性途径以调节细胞黏附力。这些研究表明，CRT通过各种机制在调节细胞黏附和迁移中发挥着关键作用。

2．4 CRT与抗肿瘤治疗 暴露在细胞表面的CRT（与破坏肿瘤细胞相关）具有一个重要的作用，就是诱导免疫应答。细胞表面的CRT有利于巨噬细胞吞噬凋亡细胞和肿瘤细胞。在多种人类肿瘤中表达在细胞表面上的CRT被认为是一个“促吞噬”的信号，且CRT的这种促吞噬功能是由抗吞噬信号CD47所中断。已有研究报道，在肿瘤细胞中一个抗吞噬信号CD47的增加伴随着CRT的高表达，从而逃避免疫系统的吞噬作用。因此，通过抗CD47抗体来阻断这种功能，可能可以增强对肿瘤细胞的吞噬和摄取，从而起到治疗作用。CRT介导的免疫机制可能为开发新的抗肿瘤疗法提供重要策略。

内质网的钙水平也与CRT易位到细胞表面有关。毒胡萝卜素治疗可导致内质网钙耗损，并升高细胞表面CRT的表达和分泌。此外，一些化学治疗剂，如蒽环类抗生素，也可以影响CRT易位到肿瘤细胞表面的过程。CRT在肿瘤细胞表面的表达对于激活免疫应答是非常重要的。因此，增加细胞表面CRT的暴露可能是研究杀死肿瘤细胞以实现抗肿瘤治疗的一个潜在方法。

3 CRT相关的信号通路

在肿瘤形成过程中，CRT通过某些通路发挥其促癌及促侵袭作用，以下是几条可能的通路。

3.1 Slug/E-钙黏蛋白通路 E-钙黏蛋白抑制肿瘤细胞迁移和侵袭，有研究证实，狗肾CRT高表达的细胞中不仅出现了E-钙黏蛋白的表达下调，还增强了细胞的迁移潜能[36]。

3.2 CTTN-PI3K-Akt信号通路 蛋白激酶B（Akt）是一种细胞重要活动的主要调节物，其活化需要与PI3K相互作用来实现。信号转导与转录激活因子（STAT3）可以调节Akt的表达，由此可诱导肿瘤细胞的增殖、生存和侵袭[37]。现已证实，在食管鳞癌细胞中，CRT作为STAT3上游的调控因子，可以增强CTTN的转录，从而间接加速PI3K/Akt通路，最终将增加肿瘤细胞的动力及对抗失巢凋亡的能力[38]。

3.3 钙通路 钙能够调节变形细胞动力的多个方面，且能诱导肌球蛋白Ⅱ的膜定位，而此蛋白最终能有效地引发细胞迁移[39]。细胞内钙的调节在细胞迁移过程中起着主要决定作用[40]。CRT可能通过其对细胞内外钙稳态的作用来诱导细胞迁移和恶性侵袭。

3.4 TSP1-CRT-LRP1信号通路 凝血酶敏感蛋白-1（TSP1）是细胞的黏附力和动力的一个主要调节因子，而这些作用是通过其氨基末端与低密度脂蛋白受体相关蛋白（CRT-LRP1）受体复合体的结合来实现的。此作用将导致细胞黏附相关性信号的表达减弱，并最终通过分解局部的黏附来增加细胞的动力。在小鼠胚胎成纤维细胞中，TSP1-CRT-LRP1通路可激活类似PI3K和Akt这样促生存信号，而这些信号可以促进对细胞凋亡的抑制作用[41]。

3.5 其他通路 已有报道，在胃癌细胞中，CRT的过表达与VEGF表达上调之间无论是在信使RNA还是蛋白水平都具有相关性[42]。这种促血管生成的作用可能是肿瘤中CRT依赖性侵袭和转移潜能的一种机制[42]。

4 展 望

在不同类型肿瘤中，CRT的异常表达水平与病理结果高度相关。CRT在内质网腔内外参与多种细胞功能。CRT的2个主要功能是蛋白质分子伴侣和钙稳态。另有研究表明，非内质网的CRT也在肿瘤的发展过程中起着关键性作用。其中一个重要的CRT介导的调节细胞黏附的机制是通过与整合素相互作用。同连接到细胞外基质一样，整合素的活化通过各种整合细胞质结合蛋白来影响细胞骨架的动力。近年来，CRT被称为整合素α亚单位的结合蛋白，其可以通过FUT1水平影响糖基化整合来促进β整合素的激活。从这一点出发，有助于更好地理解CRT是如何调节细胞黏附力的。但是CRT的真正作用还有待根据其在多种细胞活动中的相互作用和信号通路进行证实，并有望通过高通量分析平台得到进一步阐明。后续研究重点不仅应放在划分CRT促进恶性发展和促进侵袭的机制上，同时还要集中研究确定可能的相关基因和信号通路，这些研究结果将明确CRT在肿瘤生物学中的作用及对临床的指导作用。

[1]Goitea VE，Hallak ME.Calreticulin and arginylated calreticulin have different susceptibility to proteasomal degradation[J].J Biol Chem，2015，290（31）：16403-16414.

[2]Holmström MO，Ocias LF，Kallenbach K，et al.New disease markers within the chronic myeloproliferative neoplasms[J].Ugeskr Laeger，2015，177（19）：V12140653.

[3]Sazawal S，Singh N，Mahapatra M，et al.Calreticulin mutation profile in Indian patients with primary myelofibrosis[J].Hematology（2015-05-11）[2015-06-11].http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Calreticulin+ mutation+profile+in+Indian+patients+with+primary+myelofibrosis.

[4]Zhang F，Zhang J，Liu M，et al.Combating HER2-overexpressing breast cancer through induction of calreticulin exposure by Tras-Permut Cross-Mab[J].Oncoimmunology，2015，4（3）：e994391.

[5]Labriola CA，Conte IL，López Medus M，et al.Endoplasmic reticulum calcium regulates the retrotranslocation of Trypanosoma cruzi calreticulin to the cytosol[J].PLoS One，2010，5（10）：e13141.

[6]Bezu L，Gomes-de-Silva LC，Dewitte H，et al.Combinatorial strategies for the induction of immunogenic cell death[J].Front Immunol，2015，6：275.

[7]Singh M，Metwal M，Kumar VA，et al.Identification and molecular characterization of 48 kDa calcium binding protein as calreticulin from finger millet（Eleusine coracana）using peptide mass fingerprinting and transcript profiling[J].J Sci Food Agric（2015-02-14）[2015-04-11].http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Identification+and+molecular+characterization+of+48+kDa+calcium+binding+protein+as+calreticulin+from+ finger+millet+（Eleusine+coracana）+using+peptide+mass+fingerprinting+ and+transcript+profiling.

[8]Araki K，Nagata K.Protein folding and quality control in the ER[J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2012，4（8）：a015438.

[9]Tannous A，Pisoni GB，Hebert DN，et al.N-linked sugar-regulated protein folding and quality control in the ER[J].Semin Cell Dev Biol，2015，41：79-89.

[10]Szabo E，Qiu Y，Baksh S，et al.Calreticulin inhibits commitment to adipocyte differentiation[J].J Cell Biol，2008，182（1）：103-116.

[11]Bibi A，Agarwal NK，Dihazi GH，et al.Calreticulin is crucial for calcium homeostasis mediated adaptation and survival of thick ascending limb of Henle′s loop cells under osmotic stress[J].Int J Biochem Cell Biol，2011，43（8）：1187-1197.

[12]Xu FF，Tao TQ，Wang XR，et al.Cytosolic calreticulin inhibits microwave radiation-induced microvascular endothelial cell injury through the integrinfocal adhesion kinase pathway[J].Microcirculation，2014，21（8）：717-729.

[13]Lu YC，Chen CN，Wang B，et al.Changes in tumor growth and metastatic capacities of J82 human bladder cancer cells suppressed by down-regulation of calreticulin expression[J].Am J Pathol，2011，179（3）：1425-1433.

[14]Papp S，Fadel MP，Kim H，et al.Calreticulin affects fibronectin-based cell-substratum adhesion via the regulation of c-Src activity[J].J Biol Chem，2007，282（22）：16585-16598.

[15]Liu SH，Lee WJ，Lai DW，et al.Honokiol confers immunogenicity by dictating calreticulin exposure，activating ER stress and inhibiting epithelialto-mesenchymal transition[J].Mol Oncol，2015，9（4）：834-849.

[16]Vera C，Tapia V，Kohan K，et al.Nerve growth factor induces the expression of chaperone protein calreticulin in human epithelial ovarian cells[J]. Horm Metab Res，2012，44（8）：639-643.

[17]Shih YY，Nakagawara A，Lee H，et al.Calreticulin mediates nerve growth factor-induced neuronal differentiation[J].J Mol Neurosci，2012，47（3）：571-581.

[18]Zamanian M，Veerakumarasivam A，Abdullah S，et al.Calreticulin and cancer[J].Pathol Oncol Res，2013，19（2）：149-154.

[19]Lwin ZM，Guo C，Salim A，et al.Clinicopathological significance of calreticulin in breast invasive ductal carcinoma[J].Mod Pathol，2010，23（12）：1559-1566.

[20]Shi F，Shang L，Pan BQ，et al.Calreticulin promotes migration and invasion of esophageal cancer cells by upregulating neuropilin-1 expression via STAT5A[J].Clin Cancer Res，2014，20（23）：6153-6162.

[21]Sheng W，Chen C，Dong M，et al.Overexpression of calreticulin contributes to the development and progression of pancreatic cancer[J].J Cell Physiol，2014，229（7）：887-897.

[22]Chiang WF，Hwang TZ，Hour TC，et al.Calreticulin，an endoplasmic reticulum-resident protein，is highly expressed and essential for cell proliferation and migration in oral squamous cell carcinoma[J].Oral Oncol，2013，49（6）：534-541.

[23]Kabbage M，Trimeche M，Bergaoui S，et al.Calreticulin expression in infiltrating ductal breast carcinomas：relationships with disease progression and humoral immune responses[J].Tumour Biol，2013，34（2）：1177-1188.

[24]Peng RQ，Chen YB，Ding Y，et al.Expression of calreticulin is associated with infiltration of T-cells in stageⅢB colon cancer[J].World J Gastroenterol，2010，16（19）：2428-2434.

[25]Minami S，Nagashio R，Ueda J，et al.Detection of tumor-associated antigens in culture supernatants using autoantibodies in sera from patients with bladder cancer[J].Biomed Res，2014，35（1）：25-35.

[26]Vaksman O，Davidson B，Tropé C，et al.Calreticulin expression is reduced in high-grade ovarian serous carcinoma effusions compared with primary tumors and solid metastases[J].Hum Pathol，2013，44（12）：2677-2683.

[27]Chang HH，Lee H，Hu MK，et al.Notch1 expression predicts an unfavorable prognosis and serves as a therapeutic target of patients with neuroblastoma[J].Clin Cancer Res，2010，16（17）：4411-4420.

[28]Klampfl T，Gisslinger H，Harutyunyan AS，et al.Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms[J].N Engl J Med，2013，369（25）：2379-2390.

[29]Sun C，Zhang S，Li J.Calreticulin gene mutations in myeloproliferative neoplasms without Janus kinase 2 mutations[J].Leuk Lymphoma，2015，56（6）：1593-1598.

[30]Raghavan M，Wijeyesakere SJ，Peters LR，Del CN.Calreticulin in the immune system：ins and outs[J].Trends Immunol，2013，34（1）：13-21.

[31]Sene A，Chin-Yee D，Apte RS.Seeing through VEGF：innate and adaptive immunity in pathological angiogenesis in the eye[J].Trends Mol Med，2015，21（1）：43-51.

[32]Liang X，Xu F，Li X，et al.VEGF signal system：the application of antiangiogenesis[J].Curr Med Chem，2014，21（7）：894-910.

[33]Shu Q，Li W，Li H，et al.Vasostatin inhibits VEGF-induced endothelial cell proliferation，tube formation and induces cell apoptosis under oxygen deprivation[J].Int J Mol Sci，2014，15（4）：6019-6030.

[34]Weng WC，Lin KH，Wu PY，et al.Calreticulin Regulates VEGF-A in Neuroblastoma Cells[J].Mol Neurobiol，2014，18（4）：786-798.

[35]Ihara Y，Inai Y，Ikezaki M.Alteration of integrin-dependent adhesion and signaling in EMT-like MDCK cells established through overexpression of calreticulin[J].J Cell Biochem，2011，112（9）：2518-2528.

[36]Hayashida Y，Urata Y，Muroi E，et al.Calreticulin represses E-cadherin gene expression in Madin-Darby canine kidney cells via Slug[J].J Biol Chem，2006，281（43）：32469-32484.

[37]Yu H，Pardoll D，Jove R.STATs in cancer inflammation and immunity：a leading role for STAT3[J].Nat Rev Cancer，2009，9（11）：798-809.

[38]Du XL，Yang H，Liu SG，et al.Calreticulin promotes cell motility and enhances resistance to anoikis through STAT3-CTTN-Akt pathway in esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncogene，2009，28（42）：3714-3722.

[39]Lusche DF，Wessels D，Soll DR.The effects of extracellular calcium on motility，pseudopod and uropod formation，chemotaxis，and the cortical localization of myosinⅡin Dictyostelium discoideum[J].Cell Motil Cytoskeleton，2009，66（8）：567-587.

[40]Titushkin I，Cho M.Regulation of cell cytoskeleton and membrane mechanics by electric field：role of linker proteins[J].Biophys J，2009，96（2）：717-728.

[41]Pallero MA，Elzie CA，Chen J，et al.Thrombospondin 1 binding to calreticulin-LRP1 signals resistance to anoikis[J].FASEB J，2008，22（11）：3968-3979.

[42]Chen CN，Chang CC，Su TE，et al.Identification of calreticulin as a prognosis marker and angiogenic regulator in human gastric cancer[J].Ann Surg Oncol，2009，16（2）：524-533.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.021

A

1009-5519（2015）21-3265-04

2015-06-25）

金明（1988-），女，湖南长沙人，硕士研究生，主要从事临床病理学的研究；E-mail：779193076@qq.com。