超声波辅助植物复合酶提取中药茯苓多糖的工艺优化研究

2015-02-22陈小红马芳林标声沈绍新龙岩学院生命科学学院福建龙岩364012

长江大学学报(自科版) 2015年27期

陈小红，马芳，林标声，沈绍新　(龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364012)

陈小红，马芳，林标声，沈绍新(龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364012)

[摘要]比较了单独超声提取与超声辅助植物酶法提取茯苓多糖的效果,结果表明,超声辅助酶法能显著地提高多糖的浸出率和提取率(P<0.05),其最大多糖浸出率、提取率分别为5.54%、4.72%,明显地提高了水溶性茯苓多糖的提取效率。通过正交试验,确定了超声辅助酶法提取茯苓多糖的最优工艺条件:粉碎粒度20~60目、料水比1∶5、提取次数1次、提取功率90W、提取时间30min、提取温度50℃、加酶量2.0%、酶解温度50℃、酶解pH5.0、酶解时间120min。超声辅助植物酶法是提取水溶性茯苓多糖的有效方法。

[关键词]茯苓多糖;超声波;植物复合酶;优化

茯苓(Poriacocos)是我国传统的药食同源食用真菌，在许多种药品配方中都见其身影，主要起到安神、利尿、健脾、和胃、渗湿等功效[1]。茯苓多糖是茯苓起主要功效的活性成分，主要结构为β-(1→3)-D-葡聚糖，含量最高可达84.2%[2]。茯苓多糖分为水溶性和碱溶性多糖，一直以来，通过多种方法获得的水溶性多糖提取率很低，最高产率大约在2.0%左右[3]，严重影响了茯苓多糖的开发与利用。茯苓中茯苓多糖含量高、提取率低的原因可能与茯苓细胞壁结构有关，茯苓多糖主要存在于细胞壁中，由于受到细胞壁纤维素成分的阻遏，因而提取率低[4]。近年来，国内外报到了多种茯苓多糖的提取方法，有热水浸提法、酸碱浸提法、酶法、微波辅助提取、超声波辅助提取等方法[5]，但一般报道的多为单一使用的方法，相互结合的提取方法较少报道[6~7]。超声波能增强分子的运动速度和频率，使溶剂到物质之间的穿透力增强，从而提高物质有效成分溶出的次数和速度，提高活性物质的提取率[8]。植物复合酶中含有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、中性蛋白酶等成分，各酶系之间有较好的协同作用，有利于破解植物细胞壁，快速溶解果胶及各类易浑物质，且不破坏植物细胞内的各活性成分，因此有助于缩短生产周期，提高提取率[9]。因此，本研究将超声波提取与植物复合酶提取相结合提取中药茯苓水溶性多糖，并对其工艺条件进行优化，旨在提高水溶性茯苓多糖的提取率，为茯苓多糖的有效开发与利用提供参考。

1材料与方法

1.1　试验材料及仪器

茯苓：市场购买的中药茯苓块；植物复合酶：购自宁夏夏盛实业集团有限公司，1kg/袋；主要仪器有YF-103型手提高速中药粉碎机、86-2型磁力加热搅拌器、7DL80-2B型低速台式离心机、HH-S1数显恒温水浴锅、KH-1000TDE数控超声波清洗器。

1.2　方法

1.2.1水溶性茯苓多糖的提取工艺流程及方法

茯苓→粉碎→过筛→加水、超声提取→过滤得滤液、滤渣→滤渣再超声提取1～3次→合并几次滤液，苯酚硫酸法测定滤液中多糖含量[10]，计算滤液多糖总质量、多糖的浸出率→滤渣用温水溶解、加复合酶酶解→过滤得酶解液、滤渣→滤渣再酶解1次→合并酶解液，并与原超声提取液合并，用苯酚硫酸法测定合并液中多糖含量→计算合并液多糖总质量、多糖的浸出率。

多糖的提取：将合并液真空浓缩，利用Savage法除蛋白后加入3倍量95%乙醇沉淀，4℃冰箱静置过夜，离心取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再用大孔树脂纯化、透析、冷冻干燥得茯苓多糖，称重[11]。

按下述公式计算多糖的浸出率和提取率。

多糖的浸出率=测定的溶液中多糖总质量/原取的茯苓块质量×100%

多糖的提取率=称重的茯苓多糖质量/原取的茯苓块质量×100%

1.2.2超声提取茯苓多糖的工艺条件优化

表1　Plackett-Burman试验设计的因素水平表和编码

药材的粉碎粒度、药材溶解的料水比、超声提取的次数、超声提取的功率、超声提取的时间、超声提取的温度6个因素对超声提取茯苓多糖影响较大，采用响应面分析法中Plackett-Burman试验设计，以茯苓多糖的浸出率为响应值考察影响提取效果的显著因素，6个因素Plackett-Burman试验设计如表1所示。

在Plackett-Burman试验设计的基础上，选择对响应值影响显著的关键因素进行正交试验的优化试验，同样以茯苓多糖的浸出率为指标确定影响超声提取多糖效果的最佳工艺条件，并进行最佳工艺条件下的验证性试验。

1.2.3超声辅助植物酶法提取茯苓多糖的工艺条件优化

在上述超声提取茯苓多糖工艺优化的基础上，选择最佳的工艺条件进行辅助酶法的后续试验，影响酶法提取的因素条件有加酶量、酶解温度、酶解pH、酶解时间，选定上述4个因素进行正交试验的优化试验，以茯苓多糖的浸出率为确定影响超声辅助酶法提取多糖效果的最佳工艺条件，并进行最佳工艺条件下的验证性试验。

分别在最佳工艺条件下，对比分析单独超声提取和超声辅助植物酶法提取茯苓多糖的浸出率和提取率。

2结果与分析

2.1　超声提取茯苓多糖的工艺条件优化

利用Minitab 15软件对表1的Plackett-Burman试验设计进行拟合和方差分析，结果如表2、表3所示。结果表明：影响超声提取茯苓多糖效果的因素重要性依次排序是粉碎粒度(目)(X1)﹥提取功率(X4)﹥提取温度(X6)﹥提取次数(X3)﹥料水比(X2)﹥提取时间(X5)。其中，粉碎粒度(目)(X1)、提取功率(X4)、提取温度(X6)对响应值的影响达到了显著水平，因而选定此3个水平做进一步的正交试验分析。

表2　Plackett-Burman试验设计及响应值

表3　Plackett-Burman试验设计各因素影响结果分析

粉碎粒度(目)、提取功率、提取温度3个因素对超声茯苓多糖提取的正交试验结果如表4所示。结果表明：3因素的重要性依次为为A>B>C，即粉碎粒度(目)>提取功率>提取温度，该结果与Plackett-Burman试验设计各因素显著性分析一致，最优的组合为A2B3C2，即粉碎粒度20～60目、提取功率90W、提取温度50℃。

结合上述Plackett-Burman试验设计结果，按照经济和效益的原则，选定单独超声提取茯苓多糖的最佳工艺条件为粉碎粒度20～60目、料水比1︰5、提取次数1次、提取功率90W、提取时间30min，提取温度50℃。在上述最优条件下进行3次的超声提取的验证试验，所得的多糖浸出率均值为4.21%。

表4　单独超声提取正交试验结果

2.2　超声辅助植物酶法提取茯苓多糖的工艺条件优化

加酶量、酶解温度、酶解pH、酶解时间是使用植物酶提取茯苓多糖的4个影响因素，因此同样选定L934正交试验表进行优化试验，结果如表5所示，结果表明：4因素的重要性依次为为C>A>B>D，即酶解pH>加酶量>酶解温度>酶解时间，最优的组合为C2A3B2D3，即酶解pH5.0、加酶量2.0%、酶解温度50℃、酶解时间120min。在上述最优条件下进行3次的超声植物酶辅助提取的验证试验，所得的多糖浸出率均值为5.54%。

表5　超声辅助酶法提取正交试验结果

2.3　2种提取方法的对比分析

单独超声提取和超声辅助植物酶法提取茯苓多糖3次验证试验浸出率、对应提取率的均值比较结果如表6所示，结果表明：2种提取方法多糖浸出率和对应提取率均存在显著差异，超声辅助酶法提取效果要明显好于单独超声提取，且差别明显(P<0.05)。超声辅助酶法的多糖提取率均值可以达到4.72%，比报道的水溶性茯苓多糖最高提取率在2.0%左右有了明显的提高，超声辅助酶法提取水溶性茯苓多糖取得了较好的结果。

表6　2种多糖提取方法比较

3小结

本研究比较了单独超声提取与超声辅助植物酶法提取茯苓多糖的效果，结果表明超声辅助酶法能显著提高多糖的浸出率和提取率(P<0.05)，其最大多糖浸出率、提取率分别为5.54%、4.72%，明显地提高了水溶性茯苓多糖的提取效率。通过正交试验，优化得到了超声辅助酶法提取茯苓多糖的最优工艺条件为：粉碎粒度20～60目、料水比1∶5、提取次数1次、提取功率90W、提取时间30min、提取温度50℃、加酶量2.0%、酶解温度50℃、酶解pH5.0、酶解时间120min。

茯苓多糖难溶于水，导致其水溶性多糖的提取率较低[12]。植物复合酶可以降低多糖的分子质量和

分子间粘度，提高其水溶性；且植物复合酶在常温和非有机溶剂条件下进行提取，不易破坏多糖结构，有利于保持生物活性[13]。而超声波提取天然活性成分具有效率高、周期短、活性损失低等特点[14]。因此，本研究选定超声辅助植物酶法提取水溶性茯苓多糖，有效地结合了超声波提取与酶法提取2种方法，使得茯苓中多糖的浸出更为充分，提取率更高，且该提取方法操作较为温和、多糖的活性及立体结果更不容易被破坏，是一种较好的茯苓多糖提取方法。

[参考文献]

[1]付玲，于淼.茯苓研究的新进展[J].新疆中医药，2005，2(3)：80～82.

[2]李俊，韩向晖，李仲洪，等.茯苓多糖的提取及含量测定[J].中国现代应用药学，2000，17(1)：49.

[3]赵声兰，赵荣华，陈东，等.茯苓皮中茯苓多糖的提取工艺优化[J].时珍国医国药，2006.17(9)：1730～l732.

[4]龚志华，邓燕莉，陈芳，等.植物复合酶SPE-002提取茯苓多糖工艺研究[J].湖南农业大学学报(自然科学版)，2010，36(5)：565～568.

[5]高杰，李玉欣，于占华，等.茯芩多糖提取方法研究[J].吉林中医药，2007，27(9)：60.

[6]林标声，杨生玉，姜辉,等.茯苓液体培养法中羧甲基茯苓多糖(CMP)的提取、纯化及鉴定[J].河南大学学报(自然科学版)，2008，38(3):275～280.

[7]才玉婷，武蕾蕾，王晶华，等.茯苓多糖提取方法研究进展[J].牡丹江医学院学报，2009，30(6)：58～60.

[8]张颖.对茯苓多糖提取方法的比较研究[J].中国实用医药，2012，7(4)：249～250.

[9]吴鹏，陈龙，郭峰，等.生物复合酶在植物提取中的应用研究[J].中国现代中药，2008，10(1)：31.

[10]丰朝霞，张鸿.分光光度法测定茯苓中多糖总糖含量[J].时针国医国药，2000，l1(2)：109.

[11]张晓娟，胡选萍，冯自立，等.微波辅助酶法提取茯苓中茯苓多糖的工艺研究[J].安徽农业科学，2009，37(28)：l3793～13794，l3796.