牛皮杜鹃嫩茎段试管内高效再生方法

2015-02-21顾地周杨丽娟王曼宁刘宇赵明明沈红梅朱俊义周繇

山东农业大学学报（自然科学版） 2015年5期

关键词：嫩茎腋芽茎段

顾地周,杨丽娟,王曼宁,刘宇,赵明明,沈红梅,朱俊义,周繇

通化师范学院生命科学学院,吉林通化134002

牛皮杜鹃嫩茎段试管内高效再生方法

顾地周,杨丽娟,王曼宁,刘宇,赵明明,沈红梅,朱俊义,周繇

通化师范学院生命科学学院,吉林通化134002

本研究以牛皮杜鹃嫩茎段为外植体，通过均匀设计法对影响牛皮杜鹃腋芽萌发生长同时生根的各主要因素及其水平的作用进行了实验探讨，旨在探索一种试管内牛皮杜鹃高效植株的再生方法。结果表明，最适合牛皮杜鹃嫩茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基为：基本培养基+KT 0.13～0.14 mg·L-1+IBA 0.05～0.08 mg·L-1+NAA 0.02～0.05 mg·L-1+GA32.70～2.90 mg·L-1，植株再生率为99.2%。以再生植株茎节为材料进行快繁的结果表明，在28 d的培养周期内，每段平均增殖6倍以上。再生植株的移栽成活率达96.0%以上。成功建立了高效植株再生体系，所建立的高效植株再生体系适合于牛皮杜鹃种苗工厂化生产。

牛皮杜鹃;嫩茎;均匀设计法;植株再生

牛皮杜鹃(Rhododendron chrysanthum Pall.)为杜鹃花科杜鹃花属常绿灌木，为吉林省重点保护植物，为我国国家三级保护的珍贵稀有植物，全株挥发油含量较高，油中还有黄酮类强心苷，为精油和药用植物。其具有抗性极强的特性，是杜鹃花育种的种质资源。牛皮杜鹃对水土保持和维持生态平衡起重要作用，适合应用于我国东北及西北地区的园林绿化植物。但其在我国分布甚狭，仅在长白山有较大种群分布，其它地区仅为零星分布，由于人们乱采乱挖，野生资源遭到极大威胁。牛皮杜鹃花种子细小，萌发率低，萌发后形成的小苗成活率极低[1,2]；扦插繁殖需要大量的野生杜鹃枝条，对野生资源破坏极大，且生根率和移栽成活率极低，开发和利用受到极大限制。目前，牛皮杜鹃的离体繁殖报道较多[3-6]，通过愈伤组织再分化芽苗、腋芽丛生和直接再生等途径具有增殖系数高等优点，但仍存在外植体诱导愈伤组织再分化、腋芽丛生和直接再生周期较长，获得不定芽再进一步生根速度较慢、步骤复杂、成本高、可操作性差，长期连续增殖极易发生退化和变异等缺点。本研究的目的是针对上述不足而探索一种方法可行、步骤简捷、成本低和繁殖速度快的利用牛皮杜鹃嫩茎段试管内高效植株再生方法。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

10月下旬，于长白山国家级自然保护区采牛皮杜鹃枝条，并将枝条用塑料袋包好后放入冰柜内低温休眠，温度控制在-10～-5℃，60 d后取出并将顶芽去除，在300倍液的赤霉素溶液中水培促其侧芽萌发生长，待侧芽萌发长至2.50 cm左右时，将鲜嫩的侧芽剪下，用75%乙醇（体积分数）涮洗60 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡8 min，无菌水冲洗10次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后将茎段切割成小茎段，每个小茎段含1个叶片作为外植体备用。

1.2 牛皮杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长、高频植株再生和炼苗移栽

基本培养基成分及含量[7]：87 mg·L-1(NH4)2SO4，375 mg·L-1NH4NO3，180 mg·L-1KNO3，320 mg·L-1CaCl2·2H2O，245 mg·L-1MgSO4·7H2O，436 mg·L-1KH2PO4；18.4 mg·L-1FeSO4·7H2O，24.9 mg·L-1Na2·EDTA·2H2O；12.4 mg·L-1MnSO4·4H2O，7.2 mg·L-1ZnSO4·7H2O，5.7 mg·L-1H3BO3，0.32 mg·L-1KI，0.05 mg·L-1Na2MoO4·2H2O；0.3 mg·L-1盐酸硫胺素(VB1)，0.25 mg·L-1烟酸，75 mg·L-1肌醇，0.25 mg·L-1甘氨酸。培养基中附加的植物生长调节物质初步范围为：激动素KT(0.03～0.10 mg·L-1)、吲哚丁酸IBA(0.10～0.45 mg·L-1)、萘乙酸NAA(0.06～0.13 mg·L-1)和赤霉素GA3(1.40～2.60 mg·L-1)，琼脂粉7.8 g·L-1，添加蔗糖10.0 g·L-1，调节pH值至5.6，牛皮杜鹃嫩茎段在光照周期9 h·d-1、光照强度1000 lx和温度(23±2)℃条件下培养。

首先将外植体茎段接种到培养基：基本培养基+GA32.50 mg·L-1中进行腋芽萌发培养，待外植体茎段在试管内腋芽萌发长至2.00 cm左右时（图1a），将腋芽剪下切割成1叶1段进行茎段生根和腋芽萌发生长的影响因素筛选。为提高牛皮杜鹃嫩茎段的生根率和腋芽萌发生长长度，通过均匀设计法设计实验[8-10]，选用U13(134)和U11(113)均匀表，每个处理接种10个嫩茎段，重复3次，筛选牛皮杜鹃茎段生根和腋芽萌发生长的激动素、吲哚丁酸、萘乙酸和赤霉素最佳浓度配比。茎段培养28 d统计生根率和腋芽萌发后生长长度。生根率=（生根的茎段数/接种的茎段总数）×100%，茎段腋芽长度为1个培养周期过程中，茎段腋芽萌发生长后的长度（不包括原茎段长度）。

以再生植株茎节为材料，采取节增殖方式开展快繁[11-13]，小植株生长至3.50 cm左右时，在无菌状态下打开培养瓶，将小植株留1叶剪下苗干，并切割成1叶1段的小茎段后，再次将小茎段转接到生根同时腋芽萌发生长培养基中进行培养，计算出每个茎段生根和生长及每瓶的增殖倍数和周期。

当牛皮杜鹃种苗扩繁到一定数量后，且小植株长至适宜高度时，将小植株从培养瓶中取出，放在高锰酸钾溶液中（浓度为10 mg/L）洗净根上的琼脂，将小植株栽植到经多菌灵溶液消毒过的草炭土、腐烂松针和河砂的混合基质中，覆盖塑料薄膜（透光性好）进行保湿保温，控制温度为(18±2)℃，保持相对湿度在70%～75%之间，12 h/d的自然光照，湿度过高或中午温度升高时，将薄膜打开小口进行换气通风，湿度降低时，可在早上喷洒适量清水。

炼苗一段时间后可揭去塑料薄膜，定期于早上喷洒一次清水，并适时喷施适宜浓度的KH2PO4溶液，苗高达到一定高度时，连同根部土块定植盆中，加强肥水管理。

1.3 数据处理与分析

通过均匀设计法进行试验设计，数据经分析处理后摸索出各主要因素对嫩茎段生根和腋芽萌发生长的影响，再进一步验证或补充实验筛选影响牛皮杜鹃嫩茎段生根和腋芽萌发生长的主要因素的适宜浓度，确定嫩茎段生根和腋芽萌发生长的培养基，在此基础上获得牛皮杜鹃嫩茎段生根同时腋芽萌发生长的最佳培养基。均匀设计软件采用Uniform Design 3.0V。

2 结果与分析

2.1 影响牛皮杜鹃嫩茎段生根和腋芽萌发生长的KT、IBA、NAA和GA3及其浓度初步筛选

数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y1=81.8+221X1－17.5X2－111X3，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.9536，剩余标准差S＝2.0600，检验值Ft＝30.12＞临界值F(0.05,3,9)＝3.863，回归方程具有显著性。通过计算激动素、吲哚丁酸和萘乙酸对生根的贡献值和贡献率可知，U1＝256，U1/U＝66.4%；U2＝29.5，U2/U＝7.66%；U3＝48.7，U3/U＝12.6%。

数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y2=－0.270+13.7X1－1.27X2+0.729X4，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.8996，剩余标准差S＝0.1860，检验值Ft＝12.73＞临界值F(0.05,3,9)＝3.863，回归方程具有显著性。同理，计算激动素、吲哚丁酸和赤霉素对茎段腋芽萌发生长的贡献值和贡献率可知，U1＝0.947，U1/U＝71.5%；U2＝0.193，U2/U＝14.5%；U4＝0.779，U4/U＝58.8%。

表1 影响牛皮杜鹃嫩茎段生根和腋芽萌发生长主要因素筛选的U13(134)试验设计与结果Table1 U13(134)test design and result of effect on the main factors for rooting and axillary bud growing of stems of Rhododendron chrysanthum Pall.

2.2 KT、IBA和NAA浓度交叉配比对牛皮杜鹃嫩茎段生根的影响

由2.1中筛选结果可知，KT、IBA和NAA对嫩茎段生根影响显著，GA3对嫩茎段生根影响不显著。因激动素与生根率呈正相关，而吲哚丁酸和萘乙酸与生根率呈负相关。通过回归分析推测质量浓度高于0.10 mg·L-1的激动素，吲哚丁酸和萘乙酸质量浓度分别低于0.10 mg·L-1和0.06 mg·L-1时，生根率可能更高。为验证此推测的可能性，又以激动素为0.10～0.15 mg·L-1，吲哚丁酸质量浓度为0.00～0.10 mg·L-1，萘乙酸质量浓度为0.00～0.06 mg·L-1开展11个水平的验证试验(表2)，重复3次取平均值。具体操作按1.1和1.2方法，结果发现，激动素质量浓度为(0.12～0.14 mg·L-1)、吲哚丁酸质量浓度为(0.03～0.08 mg·L-1)和萘乙酸质量浓度为(0.02～0.05 mg·L-1)时，牛皮杜鹃嫩茎段生根率提高（图1b），平均生根率最高可达99.9%，且比表1所列13个处理的生根率高。

表2 影响牛皮杜鹃嫩茎段生根主要激素水平筛选的U11(113)试验设计与结果Table2 U11(113)test design and result of effect on the main hormones with levels for stems rooting of Rhododendron chrysanthum Pall.

2.3 KT、IBA和GA3浓度交叉配比对牛皮杜鹃茎段腋芽萌发生长的影响

由2.1中筛选结果可知，KT、IBA和GA3对茎段腋芽萌发生长影响显著，NAA对茎段腋芽萌发生长影响不显著。因激动素和赤霉素与茎段腋芽萌发生长呈正相关，而吲哚丁酸与茎段腋芽萌发生长呈负相关。通过回归分析预测激动素和赤霉素的质量浓度分别高于0.10 mg·L-1和2.60 mg·L-1，以及低于0.10 mg·L-1的吲哚丁酸可能茎段腋芽萌发生长更好。为验证此预推测的可能性，又以激动素为0.10～0.15 mg·L-1，吲哚丁酸质量浓度为0.00～0.10 mg·L-1，赤霉素为2.60～3.00 mg·L-1开展11个水平的验证试验(表3)，重复3次取平均值。结果发现，经过28 d的培养，激动素质量浓度在0.13～0.15 mg·L-1、吲哚丁酸质量浓度在0.05～0.09 mg·L-1和赤霉素质量浓度在2.70～2.90 mg·L-1范围内，牛皮杜鹃茎段腋芽萌发生长均较好（图1c），腋芽萌发后的平均生长长度最高可达3.06 cm，比表1所列13个处理的腋芽长度均大。

表3 影响牛皮杜鹃嫩茎段腋芽萌发生长主要激素水平筛选的U11(113)试验设计与结果Table3 U11(113)test design and result of effect on the main hormones with levels for axillary bud growing of stems of Rhododendron chrysanthum Pall.

由以上实验结果可知，由于影响牛皮杜鹃嫩茎段生根的因素和含量范围是激动素质量浓度为(0.12～0.14 mg·L-1)、吲哚丁酸质量浓度为(0.03～0.08 mg·L-1)和萘乙酸质量浓度为(0.02～0.05 mg·L-1)；而茎段腋芽萌发生长的的主要影响因素和含量范围为激动素(0.13～0.15 mg·L-1)、吲哚丁酸质量浓度为(0.05～0.09 mg·L-1)和赤霉素质量浓度为(2.70～2.90 mg·L-1)。因此，可以确定牛皮杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基为：基本培养基+KT(0.13～0.14 mg·L-1)+IBA(0.05～0.08 mg·L-1)+NAA(0.02～0.05 mg·L-1)+GA3(2.70～2.90 mg·L-1)。生根率最高可达99.9%，腋芽萌发后的平均生长长度最高可达3.06 cm，植株再生率99.2%以上。

2.4 牛皮杜鹃植株高效再生体系建立

按照1.2中的方法，待茎段生根和腋芽萌发生长至3.50 cm时，苗干发出7～9个叶时，在超净工作台上打开培养瓶，将小植株留1叶剪下苗干，再将苗干切割成1叶1段后，将小茎段转接到茎段生根同时腋芽萌发生长培养基中再次培养，26～28 d可完成嫩茎段生根同时腋芽萌发生长（图1d）。

根据1.2中的方法计算，增殖周期为28 d，按每瓶接种8个茎段，每个茎段在一个周期内可切割成6～7段计算，每年有n个周期（牛皮杜鹃每年12个周期）进行扩繁，年生产试管苗数为：∑年产成活种苗=8×612株，可见本方法可以满足牛皮杜鹃工厂化育苗的需要。

2.5 牛皮杜鹃小植株的炼苗和移栽

根据1.2中的方法，当牛皮杜鹃种苗扩繁到一定数量后，且小植株长至2.00 cm时，将小植株从培养瓶中取出，放在高锰酸钾溶液（浓度为10 mg·L-1）中洗净根上的琼脂，将小植株栽植到经多菌灵（50倍液）消毒过的草炭土、腐烂松针和河砂(2:3:1)的基质中，覆盖塑料薄膜（透性好）进行保湿保温，控制温度为(18±2)℃，保持相对湿度在70%～75%之间，12 h/d的自然光照，湿度过高或中午温度升高时，将薄膜打开小口进行换气通风，湿度降低时，可在早上喷洒适量清水。20 d后可揭去塑料薄膜，此时小植株平均高度达4～5 cm（图1e），炼苗成活率可达到97.6%以上，每隔15 d喷灌1次1/20基本培养基的营养液。

50 d后，待小植株生长至10 cm时（图1f），连同根部土块定植于盆中（图1g，h），每隔10 d给叶片喷施一次0.5%的KH2PO4溶液，同时每隔15 d喷灌1次1/20基本培养基的营养液，75 d后苗高可达20 cm以上（图1i），加强肥水管理，移栽成活率可达96.0%以上。

3 结论与讨论

结果表明，基本培养基+KT(0.13～0.14 mg·L-1)+IBA(0.05～0.08 mg·L-1)+NAA(0.02～0.05 mg·L-1)+GA3(2.70～2.90 mg·L-1)适合于牛皮杜鹃嫩茎段生根和腋芽萌发生长。生根率最高可达99.9%，腋芽萌发后的平均生长长度最高可达3.06 cm，植株再生率99.2%以上。当激动素、吲哚丁酸、萘乙酸和赤霉素分别低于0.13、0.05、0.02和2.70 mg·L-1或分别高于0.14、0.08、0.05和2.90 mg·L-1时，牛皮杜鹃嫩茎段生根和腋芽萌发生长均出现逐渐降低趋势，说明过低的植物生长调节物质不足以诱导牛皮杜鹃嫩茎段试管内的生根和腋芽萌发生长，而过高的植物生长调节物质对牛皮杜鹃嫩茎段试管内的生根和腋芽萌发生长起抑制作用。激动素、吲哚丁酸和萘乙酸在培养基中的作用主要是促进牛皮杜鹃嫩茎段的生根，联合使用效果较好，但对生根的贡献有所不同，通过激动素、吲哚丁酸、萘乙酸和赤霉素对牛皮杜鹃茎段生根的显著性检验可知，激动素、吲哚丁酸和萘乙酸三个因素对生根率有显著影响，而赤霉素对生根率影响不显著，激动素、吲哚丁酸和萘乙酸对生根贡献率分别为66.4%、7.66%和12.6%，表明激动素对嫩茎段的生根贡献远大于吲哚丁酸和萘乙酸，这不仅证实了牛皮杜鹃试管苗的生根对激素及其水平具有不同程度的选择性[15]，原因在于不同植物的基因型不同，而基因型决定了细胞分裂、分化和器官重建所依赖的激素种类及水平不同。而且也说明在牛皮杜鹃试管苗生根培养基中添加适宜浓度的细胞分裂素（激动素）有利于细胞向根器官功能分化。当激素浓度过高时，可诱导茎段基部形成愈伤组织，继续培养根从愈伤组织中发出，导致苗干和根中的疏导组织连接错位，在炼苗或移栽时，根随愈伤组织从苗干脱落，造成成活率下降，Danielle等[14]在1985年也报道了这一现象；其次激动素和吲哚丁酸与赤霉素联用对牛皮杜鹃嫩茎段腋芽的萌发生长具有显著促进作用，赤霉素主要起到抑制牛皮杜鹃腋芽休眠的作用，可防止腋芽因休眠导致种苗繁殖周期增长，吲哚丁酸对萌发后的腋芽的生长其关键作用，激动素主要起到协调和器官分化作用，萘乙酸对牛皮杜鹃嫩茎段腋芽的萌发生长贡献不显著，通过激动素、吲哚丁酸和赤霉素对牛皮杜鹃嫩茎段腋芽萌发生长的显著性检验可知，激动素、吲哚丁酸和赤霉素对茎段腋芽萌发生长的贡献率分别为71.5%、14.5%和58.8%，这也同时说明了激动素、吲哚丁酸和赤霉素在茎段腋芽萌发生长中的作用和地位。

牛皮杜鹃高效植株再生方式，缩短了牛皮杜鹃种苗繁殖周期，王雯雯等[16]对大字杜鹃快繁研究也确定了此方法的简捷和可行性。

目前，国内外有许多杜鹃花品种已通过人工繁殖并规模化栽培。我国野生杜鹃花品种众多，但野生常绿抗寒品种人工繁殖和开发利用极少。牛皮杜鹃是我国珍贵的野生观赏植物资源，至今得到推广应用。本结果建立了牛皮杜鹃高效植株再生体系，可为牛皮杜鹃的开发利用和工厂化育苗奠定基础和提供方法。

[1]马宏宇,赵伟,金慧,等.赤霉素处理长白山牛皮杜鹃种子发芽试验[J].北华大学学报:自然科学版,2013,14(4):462-464

[2]苏家乐,李畅,陈璐,等.不同预处理方法对牛皮杜鹃和小叶杜鹃种子萌发的影响[J].植物资源与环境学报,2011,20(4):64-69

[3]刘淼,曹后男,宗成文,等.TDZ对牛皮杜鹃叶片分化及继代增殖的影响[J].西北农业学报,2012,21(12):156-162

[4]顾地周,丛小力,姜海智,等.牛皮杜鹃的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯,2008,44(2):300

[5]李玉梅,姜云天,孙智慧.基于均匀设计优化牛皮杜鹃嫩叶直接再生芽苗及植株再生体系[J].安徽农业科学,2009,37(2):678-680

[6]顾地周,孙忠林,何晓燕,等.牛皮杜鹃的组培快繁及种质试管保存技术[J].园艺学报,2008,35(4):603-606

[7]顾地周,杨丽娟,朱俊义,等.一种利用长白山杜鹃花属植物茎段试管内高效成苗方法,中国:CN201210502941.6[P].2013-03-13

[8]顾地周,冯颖,顾美影,等.基于均匀设计优化手参体细胞胚胎发生及植株再生体系[J].中草药,2010,41(6):989-993

[9]顾地周,邓志刚,綦茂伟,等.苞叶杜鹃离体培养及种质试管保存体系的建立[J].南京林业大学学报:自然科学版,2009,33(3):20-24

[10]顾地周,高捍东,王艳萍,等.基于均匀设计优化绶草体细胞胚胎发生发育体系及扫描电镜观察[J].华南农业大学学报,2010,31(1):60-64

[11]顾地周,丛小力,姜云天,等.色木槭的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯,2008,44(2):314

[12]顾地周,丛小力,宋利丽,等.木通马兜铃的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯,2008,44(1):136

[13]姜云天,陈艳秋,顾地周,等.均匀设计法优化短果杜鹃高效快繁体系[J].安徽农业科学,2009,37(33):16268-16270

[14]高新一,王玉英.植物无性繁殖实用技术[M].北京:金盾出版社,2003

[15]DANIELLE JD,WILLIAM EV,KWAI YL.The anatomy of tissue cultured red raspberry prior to and after transfer to soil[J].Plant Cell tissue and organ culture,1985(1):43-50

[16]王雯雯,马秋月,朱俊义,等.大字杜鹃离体快繁体系建立及种质试管保存研究[J].植物研究,2009,29(2):198-203

An Efficient Plant Regeneration Method of Rhododendron chrysanthum Pall.Tender Stem Segments in Vitro

GU Di-zhou,YANG Li-juan,WANG Man-ning,LIU Yu,ZHAO Ming-ming, SHEN Hong-mei,ZHU Jun-yi,ZHOU You
College of Life Sciensce/Tonghua Normal University,Tonghua 134002,China

In this study,the young stems of Rhododendron chrysanthum were used as explants,the main factors with different levels of axillary sprouting,shoots growth and shoots rooting were investigated through uniform design experiments. To explore a method of efficient plantlet regeneration in vitro.The results showed that the basic medium+KT 0.13～0.14 mg·L-1+IBA 0.05～0.08 mg·L-1+NAA 0.02～0.05 mg·L-1+GA32.70～2.90 mg·L-1was the most suitable for axillary sprouting,shoots growth and shoots rooting,the rate of plantlet regeneration was 99.2%.Stems each with one node were cut from regenerated shoots and cultured for propagation,and a 6-fold proliferation rate was achieved within 28 days.The survival rate of regenerated plants was more than 96.0%.Efficient plantlet regeneration system of Rhododendron chrysanthum have been successfully established,which is suitable to industrialized seedling for Rhododendron chrysanthum.

Rhododendron chrysanthum Pall.;tender stem segments;uniform design method;plantlet regeneration