依诺沙星-铕络合物为探针的荧光光度法测定肝素

苗延虹*,董光霞

山东农业大学化学院,山东泰安271000

依诺沙星-铕络合物为探针的荧光光度法测定肝素

苗延虹*,董光霞

山东农业大学化学院,山东泰安271000

在pH值为7.40的HMT-HCl缓冲溶液中，铕（Eu3+）能和依诺沙星（Enoxacin）形成络合物，发出Eu3+的特征荧光，最大激发和发射波长分别为330 nm和612 nm，狭缝均为5 nm，肝素的加入能使Eu3+的特征荧光显著增强。在线性范围0.117～5.85 μg·mL-1内，肝素的浓度和荧光强度成很好的线性关系，线性方程为△F=-5.691+6.98 c（r= 0.994）（c:μg·mL-1）；检出限为0.06 μg·mL-1。本方法用于实际样品的测定，灵敏度高、选择性好、干扰少、操作简单，结果令人满意。

依诺沙星;铕;荧光光谱法;肝素

肝素具有广泛的生物学功能,在人体内由肥大细胞分泌而自然存在于血液中，在体内外均有延缓或阻止血液凝固的作用，是心血管和血栓病人的首选抗凝血药，可用于调血脂、抗血栓，改善血液流变学指标及免疫调节等，肝素或其衍生物还可广泛应用于美容、化妆行业，是一种重要的生化药物。肝素的检测以化学方法为主，文献报导有分光光度法[1-5]、共振瑞利散射法[6,7]、循环伏安法[8]、离子色谱法[9]、流动注射法[10]、高效液相色谱法[11]、荧光能量转移法[12]。这些方法中，分光光度法虽然操作简便、快速、仪器价廉，但线性范围较窄，高效液相色谱法具有检出限较低，线性范围宽的优点，但操作繁琐，仪器设备昂贵，电化学方法也不失为一种好的方法，但操作起来仍较复杂。

本文选择依诺沙星作为铕离子的配体，研究了以肝素作为共配位体，与依诺沙星共同敏化铕离子特征荧光的可能性。实验结果表明，依诺沙星-铕离子体系中铕离子位于612 nm处的特征荧光能够被肝素显著增强，且增强的荧光强度与一定范围内肝素的浓度成正比，根据这一性质。本文以ENX-Eu3+作为荧光探针，建立了一种测定肝素的新方法。本方法与上述文献报导的方法相比，灵敏度较高，选择性好，干扰少，操作简单，用于实际样品的测定，结果令人满意。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器pHS-3精密酸度计（上海自动化仪表有限公司），Cary Eclipse荧光分光光度计（美国VARIAN公司）。

1.1.2 试剂肝素钠针剂：①天津健康药业100606；②上海第一生化药业100912；依诺沙星(中国药品生物制品检定所)贮备液浓度为1.0×10-3mol·L-1,工作液浓度为2.0×10-4mol·L-1，Eu3+贮备液浓度为2.0×10-2mol·L-1,工作液浓度为1.0×10-4mol·L-1；肝素钠(中国药品生物制品检定所)贮备液浓度为1.17 mg·mL-1,工作液浓度为11.7μg·mL-1。HMT-HCl缓冲液（0.1 mol·L-1）：pH值为7.40。以上依诺沙星、肝素钠储备液与工作液均需置于0～4℃的生化培养箱内保存，所用试剂均为分析纯，实验用水为二次重蒸去离子水。

1.2 实验方法

在10 mL比色管中依次加入1.7 mL 2.0×10-4mol·L-1ENX、1.0 mLpH=7.40的HMT-HCl缓冲溶液（0.1 mol·L-1）、0.5 mL1.0×10-4mol·L-1Eu3+和1.0 mL11.7μg·mL-1Hep，二次重蒸去离子水定容至10.0 mL,振荡摇匀，10 min后,扫描荧光激发和发射光谱。在λex/λem=330 nm/612 nm处（激发和发射狭缝均为5 nm），用1 cm石英荧光液池,测定荧光强度F，同时测定试剂空白的荧光强度F0,△F=F-F0。

2 结果与讨论

2.1 激发光谱和发射光谱

实验条件浓度：ENX，3.4×10-5mol·L-1；Eu3+，0.5×10-5mol·L-1；Hep，1.17μg·mL-1；HMT-HCl，pH=7.40（0.1 mol·L-1）

按照实验方法，分别扫描ENX、Eu3+、ENX-Eu3+和ENX-Eu3+-Hep溶液的激发和发射光谱(见图1)。由图1 a可知，ENX-Eu3+-Hep溶液有三个激发峰，其中301 nm处较强，但为了避免Eu3+的直接激发以及二级散射影响，选定330 nm为激发波长，发射光谱中，曲线1，ENX在416 nm处有一个很强的发射峰，曲线2，单纯的Eu3+水溶液检测不到Eu3+的特征荧光，比较曲线1和曲线3，可以看出，ENX在416 nm处的发射强度明显降低，出现了591 nm和612 nm的Eu3+的特征荧光峰，分别对应于Eu3+的3D0-7F1，3D0-7F2能级跃迁。说明ENX和Eu3+生成了二元配合物并发生分子内能量转移，使得Eu3+激发并发射特征荧光。曲线4由于肝素钠的加入生成了Eu3+-ENX-Hep三元配合物,更有利于能量传递,使得荧光强度进一步增强。故实验选取激发和发射波长分别为为330 nm和612 nm。

图1 荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra1.ENX2.Eu3+3.ENX-Eu3+4.ENX-Eu3+-Hep

2.2 影响体系荧光强度的因素

2.2.1 酸度对体系荧光强度的影响在pH值为4.01～8.74范围内考察了溶液的酸度对体系荧光强度的影响（图2）。实验结果表明：pH=7.17～7.60时，体系的荧光强度大而且比较稳定，因此选取pH=7.40进行下一步研究。

2.2.2 缓冲液种类及用量的影响实验了以下缓冲溶液：NH3-NH4Cl、Tris-HCl、NaAc-HAc、HMT-HCl（pH值均调至7.40）对体系荧光强度的影响。结果表明：HMT-HCl缓冲体系对荧光增强效果最好。同时实验了HMT-HCl缓冲液用量的影响，结果显示：当缓冲液用量在0.8～1.2 mL时荧光较强。故选择pH=7.40的HMT-HCl缓冲溶液1.0 mL，做进一步的研究。

2.2.3 依诺沙星与铕离子的浓度比对体系荧光强度的影响固定Eu3+浓度为0.5×10-5mol·L-1，对体系在ENX浓度不同时的荧光强度进行测定（图3）。结果显示：ENX与Eu3+浓度比为(6.5～7.5):1时，体系的荧光强度较大。故选择Eu3+浓度为0.5×10-5mol·L-1(即浓度为1.0×10-4mol·L-1的Eu3+工作液加0.5 mL)，ENX浓度为3.4×10-5mol·L-1(即浓度为2.0×10-4mol·L-1的ENX工作液加1.7 mL)，即ENX与Eu3+浓度比为6.8:1做进一步的研究。

2.2.4 反应时间和加入顺序的影响在最佳实验条件下，考察了荧光强度随时间的变化情况（图4）。结果发现，当各反应组分混合后，体系的荧光强度受光照的影响较大,被荧光照射后体系变得不稳定。未经照射的体系在10 min～60 min内荧光值稳定。故选择10 min后开始测定。当改变加样顺序时，按ENX、HMT-HCl缓冲液、Eu3+、Hep的顺序加入时体系的荧光强度最大，加入稳定性也更好，稳定时间更长，故实验中选择这一加入顺序。

图2 pH值对Eu3+-ENX-Hep体系荧光强度F的影响Fig.2 The influence of pH on F of Eu3+-ENX-Hep system

图3 依诺沙星和Eu3+的浓度对体系F的影响Fig.3 The influence of ENX and Eu3+concentration on F

图4 反应时间对体系的荧光强度的影响Fig.4 The influence of reaction time on F

2.2.5 干扰物质对体系荧光强度的影响在最佳实验条件下，当肝素钠浓度为1.17μg·mL-1时，研究了一系列常见的干扰物质的影响，结果如表1所示。表中所列干扰物基本不干扰测定。

表1 干扰物质对体系荧光强度的影响Table 1 Effect of coexistent substances

2.3 工作曲线、线性范围及检出限

在最佳实验条件下，绘制了肝素钠浓度c（(g·mL-1）与△F之间的响应曲线,线性方程为△F=-5.691 +6.98c(μg·mL-1)，相关系数r=0.994，线性范围0.117～5.85μg·mL-1。取11支10 mL的比色管按实验方法配制空白溶液，测得s=0.02，检出限为0.06μg·mL-1。

图5 Hep工作曲线Fig.5 Working curve of Hep

3 肝素钠样品的测定

取两支肝素钠针剂（每支标示量为12500 IU/2 mL）：①天津健康药业批号100606，②上海第一生化药业批号100912，用二次重蒸去离子水稀释至100 mL容量瓶中，再逐级稀释至测定肝素的线性范围，利用标准曲线法按实验方法测定，结果如表2所示，同时按实验方法测定效价，结果如表3所示。由表2和表3可以看出，此方法的回收率令人满意，故此法可用于针剂中肝素的测定。

表2 肝素钠样品测定的回收率实验(n=5)Table 2 Recovery test of the determination of heparin sodium in samples(n=5)

表3 肝素钠针剂效价的测定(n=5)Table 3 Determination results of heparin in heparin sodium injection samples(n=5)

4 机理探讨

Eu3+的配位数一般是8，而从实验数据上可以看出Eu3+与ENX浓度比为1:6.8，故Eu3+是不饱和配位，配位化合物中剩余大量正电荷和空轨道。肝素作为一种生物大分子，在水溶液中以带多个负电荷的大阴离子形式存在，可与配位化合物以静电引力相互结合。同时肝素分子中含有硫酸根离子、羧基等基团，可同时参与配位。肝素的结构是由四糖单元所组成的聚合物，其四糖单元结构如图6所示,每个四糖单元有3个-OSO3H基、2个-NHSO3H基和2个-COOH基。其中-OSO3H基和-NHSO3H基在上述实验条件下能够完全离解。羧基显弱酸性且肝素中D-葡糖醛酸的pKa值为3.6，所以在上述实验条件下羧基也能完全离解。实验所用的肝素含有42个单糖单元,每个肝素四糖单元有7个结合位点(5个硫酸基和2个羧基)，所以每个肝素分子中总的结合位点数为73.5(42×7/4)。因此肝素钠可以与ENX-Eu3+配合物以静电作用和配位作用结合生成具有紧密结构的三元配合物。依诺沙星以及肝素共同作用的结果使铕离子位于612 nm处的特征荧光增强了数倍，且增强的荧光强度与肝素的加入量成正比。本文据此提出了一种以ENX-Eu3+作为荧光探针，测量肝素的新方法。该方法简便易行，反应迅速,稳定性好，灵敏度高，用于测定肝素具有较好的线性范围，用来测定针剂中肝素的含量，结果令人满意。

图6 肝素的四糖单元结构Fig.6 Structure of the tetrasaccharide unit of Hep

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Spectrofuorimetric Determination on Heparin Using Enoxacin-Europium Probe

MIAO Yan-hong*,DONG Guang-xia
College of Chemistry and Material Science/Shandong Agriculture University,Taian 271000,China

A new method for determination of Heparin by fluorometry method was established.In HMT-HCl buffer solution at pH 7.40,Eu3+formed complex with enoxacin,which emitted characteristic fluorescence of Eu3+with maximum excitation wavelength at 330 nm,maximum emission wavelength at 612 nm and slit width at 5 nm.Additional Heparin resulted in a remarkable increase in the Eu3+characteristic fluorescence.Within the range of 0.117～5.85 μg·mL-1,the concentration of Heparin had a linear relationship with the fluorescent intensity,with linear equation of△F=-5.691+6.98 c（r=0.994）（c: μg·mL-1）and detection limit of 0.06 μg·mL-1.This method generated high selectivity,high sensitivity and low disturbance, which had been applied to the determination of practical samples with satisfactory result.

Enoxacin;Europium;Spectrofluorimetric;Heparin

0657.31;Q524.6

A

1000-2324(2015)05-0648-04

2013-11-25

2014-01-20

苗延虹(1967-),女,副教授.E-mail:quguoqing@126.com

*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:quguoqing@126.com