蓝舌病病毒蛋白结构与疫苗研究进展

蓝舌病病毒蛋白结构与疫苗研究进展

张 玲1,2，王 玉1.2，谷文喜1，石保新1，易新萍1，姚 刚2，叶 锋1，马小菁1，钟 旗1*
（1.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐 830000；
2.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

蓝舌病（Bluetongue, BT）是世界动物卫生组织（0IE）规为的多种动物共患疫病，严重危害着全球畜牧业的经济发展，接种疫苗能有效的预防该病。蓝舌病病毒（Bluetonguevirus，BTV）属于呼肠孤病毒科环状病毒属，该病毒通过媒介昆虫(库蠓)叮咬牛、羊、鹿等易感反刍动物进行传播，可引起易感动物的出血性传染性疾病。BTV的10个双股RNA基因片段编码7种结构蛋白（VP1~VP7）和5种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3、NS3α和NS4）。其中BTV双层蛋白衣壳中，外壳蛋白VP2和VP5是BTV型特异性抗原，内壳蛋白VP3和VP7含有BTV群特异性抗原决定簇。本文概述与总结了上述蛋白的结构、功能与研究情况和对目前国内外BT弱毒疫苗、灭活疫苗、病毒样颗粒及重组疫苗的研究进展。

蓝舌病病毒；病毒蛋白；疫苗

修回日期：2015-02-15

蓝舌病（Bluetongue, BT）是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的经媒介昆虫如库蠓、伊蚊等传播的非接触性病毒性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将BT规为多种动物共患疾病，为上报疾病[1]。该病主要侵害绵羊，并可感染牛和其他多种反刍动物且呈现隐性感染。该病的临床表现以面部充血和出血、发炎和水肿为主要特征的发热反应，同时伴有粘膜溃疡。妊娠动物感染后可经胎盘垂直传染胎儿，引起流产、死胎等。BT通过库蠓等吸血昆虫叮咬带病毒血症的动物血液感染病毒并在易感动物之间传播BTV，感染病毒的库蠓终身带毒。库蠓作为该病的传播媒介影响BT的流行，因此BT在许多地区呈季节性流行。随着全球气候变暖的加快，BT分布范围也在逐渐扩大。

1 蓝舌病概述

第一次发现BT病毒是19世纪南非[2]。在20世纪初，伴随着进出口贸易的发展，蓝舌病在非洲广泛传播。随后在美国，非洲，亚洲等世界范围内传播，1996年造成了三十亿美元的损失[3]。在1998年以前，蓝舌病只是短暂的发生在欧洲南部（西班牙、葡萄牙、希腊和塞浦路斯）。然而在1998年以后，至少有八个不同的蓝舌病毒株来自六个不同的血清型（1,2,4,8,9,16）在欧洲爆发，其中包括很多北欧的国家[4,5]。在2006 年8月，BTV8最初发生在荷兰，随后在德国、比利时和法国东北部蔓延，总共引起了2 297例蓝舌病病例。冬季过后，病毒感染有较强的复发趋势，在2007年欧洲爆发面积继续扩张。2008年3月-4月，法、意等国爆发蓝舌病。2011年12月-2012年1月摩洛哥（11次）发生蓝舌病疫情，之后的10月-11月，希腊（22次）发生蓝舌病疫情，绵羊发病639只死亡626只。虽然BTV主要感染绵羊，其他的反刍动物也会感染但不呈现明显的临床症状，但是2011年爆发的BTV8使感染的牛产生了一些明显的临床症状和较低的死亡率，造成了一定的经济损失，引起了广泛关注[6]。

我国自1979年在云南省首次检测出绵羊蓝舌病后，随后相继在湖北、安徽、四川、山西等29个省均检出BTV血清阳性畜。到目前为止，已经有7个血清型（BTV1、BTV2、BTV3、BTV4、BTV12、BTV15、BTV16）在我国被发现[7,8,9]。其中BTV1和BTV16在中国流行最广。目前我国正在对BTV8进行监测，其在我国的流行情况尚不清楚。

蓝舌病的分布与中间宿主的活动情况有很大关系。大致的分布区域在北纬40度和南纬45度之间，在某些地区如北美和中国，在北纬50度内也检测到BTV[10]。并且BTV有持续向北扩张的趋势，这种分布情况的改变可能是因为全球气候变暖的原因[11]。

2 病毒的结构

BTV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)蓝舌病病毒亚群(Bluetongue virus sub-group)的成员，现共有26个血清型，其中BTV25(2008年，瑞士)和BTV26（2011年，科威特）是分别从山羊和绵羊体内检测到的新的血清型[12]。BTV可在4℃和-70℃长期保存[42]。BTV与鹿流行性出血热病毒(EHDV)有明显的免疫交叉反应。

完整的BT病毒粒子呈二十面体对称，由双链RNA组成，其分段基因组RNA 3’和5’端各含有特异的重复保守序列，为5’-GUUAAA和3’-ACUUAC。BTV基因组分10个片段，可编码7种结构蛋白（VP1-7）和5种非结构蛋白（NS1-3、NS3A和NS4）。BTV是双层衣壳，最外层由两个结构蛋白构成，分别是VP2 （111 kDa）和VP5（59kDa）。核心衣壳由VP3（100 kDa）、VP7（38 kDa）两种主要结构蛋白和VP1（149 kDa）、VP4（76 kDa)、VP6（36 kDa)三种次要结构蛋白构成。5种非结构蛋白可能参与了BTV的复制、“裁剪”和运输,是在被BTV感染的细胞中合成的[13]。

2.1 病毒蛋白

2.1.1外衣壳蛋白VP2、VP5

VP2是由L2基因编码，是BTV型特异性抗原，是BTV血清型的主要决定因素，能引起血凝，诱导产生中和抗体，与病毒的毒力和细胞吸附作用有关。VP2蛋白与红细胞表面的血型糖蛋白A具有很强烈的亲和力，使BTV与血细胞相结合[14]。此外，缺失VP2的BTV不具有感染细胞的能力，说明BTV的致病力与VP2与红细胞表面糖蛋白的结合能力有关。

比较来自24个血清型的BTV毒株，发现编码VP2蛋白的Seg-2存在序列变异的现象。不同血清型的Seg-2的核苷酸序列变化从29%（BTV8和BTV18)~59%（BTV16和BTV22）[14]。通过比较来自不同地域的相同血清型的不同毒株的VP2蛋白的核苷酸序列，可以发现其中最大的差异可以达到30%[15]。说明相同血清型的BTV具有一定的地域性。目前可以利用RT-PCR技术扩增Seg-2，比较基因序列来确定血清型和地域相关性[16]。

VP5是除VP2外的另一个BTV型特异性抗原,由M5基因编码，是BT病毒唯一的糖基化蛋白。与VP2比较，VP5更加的保守，存在BTV颗粒表面，在一定程度上可以反映病毒的地域来源[17]。有实验表明，VP5是一种镶嵌式蛋白，可以介导病毒颗粒核心部分进入受体细胞质中[18]。

VP5在VP2免疫中和反应中起到了重要的增强作用[19]。因此，在研制以及检测BT疫苗时，VP2和VP5蛋白的表达水平都需要检测，这对于BTV疫苗的效力具有重要意义。2.1.2内衣壳蛋白VP3和VP7

VP3与VP7分别由L3和S7基因编码，均含有BTV的群特异性抗原决定簇。两者均是保守性蛋白，并且具有疏水性。重要的是核心蛋白对哺乳动物细胞感染率几乎为零，但是对库蠓的细胞来说却拥有比在哺乳动物细胞至少高100倍的感染率[20,21]。

VP3与内部的VP1、VP4、VP6及dsRNA紧密相连，在维持病毒内层结构的完整性起到重要作用。BTV毒力与VP3无关[22]。

在缺少VP2或者是VP5蛋白的情况下，VP7蛋白可以介导病毒颗粒与昆虫细胞结合和渗透[20]。BTV 的26种不同血清型中VP7氨基酸残基的同源性达到98%，因此目前所用的许多商品化的BTV血清学检测方法均以VP7蛋白或是其单克隆抗体（MAb）为基础进行检测，故VP7也成了研究的热点[23-24]。

2.1.3核芯蛋白VP1、VP4、VP6

在病毒颗粒内部VP1蛋白的摩尔浓度较低。VP1由L1基因编码，具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，并对Mg2+具有依赖性。其主要作用是以oligo(A)为引物扩增RNA链，同时在病毒复制过程中也起到重要作用。在27℃~37℃时VP1蛋白在哺乳动物和昆虫细胞内均具有最高活性[14]。

早期的BTVmRNA是不具有生物活性的，需要进一步修饰，才能使mRNA更稳定，并使其有效地翻译。在细胞内，参加这一过程的主要有四种酶，这四种酶的反应都需要VP4蛋白催化。这是因为VP4蛋白的晶体结构为它们提供了支架作用。

VP6蛋白具有ATP结合活性，依赖RNA ATP酶活性和解旋功能，能展开BTV的双链并辅助mRNA的合成[25]。

2.2非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS3A和NS4

在电子显微镜下观察被BTV感染的细胞，可以看到一个显著的BTV感染细胞的胞内形态特征，由大量的病毒特异性小管（直径52.3 nm，长1 000 nm）组成的多聚体NS1蛋白[14]。实验证明，NS1蛋白在病毒蛋白的合成的过程中起正调节作用[26]。

NS2蛋白主要存在于被感染细胞的细胞核附近。NS2可以与单链RNA相结合并且可以使三磷酸核苷酸水解成单磷酸核苷酸[27]。这两个功能意味着NS2蛋白在病毒复制的过程中起着重要作用。

NS1和NS2蛋白是两个较大的非结构蛋白，在被感染的细胞内这两个蛋白具有很高的表达量[28]，其中NS1表达量最高。而NS3 /NS3A蛋白在哺乳动物细胞内仅仅可以勉强检测出来，但是在昆虫体内这两种蛋白却具有很高的表达量，因此可以猜想，这两种蛋白可能的主要作用是参与了BTV在昆虫体内的传播。

S9基因除了编码结构蛋白VP6外，在其基因的开放阅读框中还编码一种非结构蛋白NS4[29]。在BTV复制过程中，在NS3和NS3A的作用下，部分新合成的病毒颗粒从细胞中释放出来并重新感染细胞。

3 疫苗的研究

目前，蓝舌病疫苗有弱毒疫苗、灭活疫苗、病毒样颗粒和重组疫苗。其中弱毒疫苗因在南非已经使用超过了50年，免疫效果仍然很好[30]。弱毒疫苗和灭活疫苗的机制是血清型特异性保护作用，这个过程中外层蛋白VP2在B细胞和T细胞的保护免疫过程中起到重要作用。BTV的26个血清型之间无交叉免疫，所以在该病流行地区，人们根据当地的血清型，选择相应的单价或多价疫苗进行免疫接种。一种理想的BTV疫苗应该能够预防流行地区内所有BTV的血清型，而对于接种动物和妊娠母畜及胎儿不产生致病作用、不会出现毒力回升，并且不与野毒株发生重组，性能稳定，价格低廉。以下介绍BTV四种疫苗。

3.1弱毒疫苗

弱毒疫苗是最早应对蓝舌病爆发的疫苗。弱毒疫苗在注射后至少一年之内都会有很好的效果，而且成本低[21]。但是对于一些易感种群弱毒疫苗任存在安全问题[31]。且有研究指出，BTV减毒活疫苗出现了各种已证实或潜在的不足，包括效价的衰减，其原因有可能与羊的品种不同有关。接种弱毒疫苗后都会出现一些轻微的临床症状，如怀孕母畜流产，死胎，产奶量下降和公畜精子质量下降等。接种动物在接种后10 d左右出现抗体。新生的羔羊可通过初乳获得抗体，这时羔羊接种疫苗，就会影响疫苗免疫的效果。近些年来，反向遗传学被应用于弱毒疫苗的研究，针对BTV1和BTV6的研究已经开展开来[13]。

3.2 灭活疫苗

相对于BTV的多价弱毒疫苗可能导致的病毒基因重组和毒力的增强，灭活疫苗的安全性更高。因此，人们首选灭活疫苗[32-34]。然而，灭活疫苗的免疫效应很差，只能诱导产生很短暂的免疫中和效应，通常它的免疫效应一般只有几个月。但是这个缺点可以通过多次注射来弥补，产生高效、长期的免疫效应[35]。欧洲食品安全局建议各国使用灭活疫苗[36]，并且自从2005年以来，欧洲的一些国家已经开始实施，包括法国和意大利[35]。但是，目前可用的灭活疫苗只能针对少数几个血清型。欧盟及欧盟成员国对于BTV-8引起的重大疫情用灭活疫苗接种防治达成共识。2008年欧洲用于控制BTV-8的两种灭活疫苗为BTVPUR ALSAPR 8(MERIAL)和BOVILIS R BTV8(Intervet/SP-AH)，经研究表明山羊两次注射接种BTVPUR ALSAP 8或BOVILIS BTV8临床保护显著，并能阻止山羊发生病毒血症[37]。

3.3病毒样颗粒(VLPs)

病毒样颗粒(VLPs)疫苗是含有病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，无病毒核酸，不能进行自主复制，可通过和病毒一样的感染途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。这种疫苗被认为是天然安全的、无需经过任何失活过程、具DIVA性质。BTV中的VP2蛋白能诱发动物产生特异性中和抗体，因此可以利用基因克隆技术生产纯化病毒外壳蛋白作为疫苗使用。有研究表明，衣壳蛋白VP2和VP5蛋白联合表达比单个VP2产生更好的免疫效应。BTV的4种结构蛋白可以利用杆状病毒作载体，转染入昆虫细胞进行表达（杆状病毒重组表达疫苗），构成类似病毒结构的病毒样颗粒。目前有实验室对BTV8的VLPs的免疫效应进行了测试，其数据表明，BTV-8 VLPs作为一个单一的抗原或作为多价疫苗的组成成免疫效果都很好，并且接种VLPs的动物注入BTV-8后没有临床表现或病毒血症。该实验进一步强调了BTV病毒样颗粒是安全有效的免疫原，对致命病毒侵入的能够提供完整的保护[38]。

3.4重组疫苗

无论是使用弱毒疫苗还是灭活疫苗，目前均没有血清学检测的方法“区分被感染的动物与疫苗接种的动物”(distinguish infected from vaccinated animals, DIVA assays)，而重组BTV疫苗的安全性相对更高，并具有DIVA性质，基于以上原因重组载体疫苗一直都是研究重点[39]。一些实验室早期的实验证明，利用痘病毒衍生载体具有较好的实验效果。实验证明，将含有VP2和VP5联合蛋白的牛痘病毒重组疫苗对羊进行免疫注射（免疫3次间隔21 d）[14]，在羊体内能产生有效地保护性免疫[40]。近年来，禽痘病毒作为哺乳动物基因工程疫苗的重要载体已被确认，尤其是其中的非复制性金丝雀痘病毒载体，以金丝雀痘病毒为载体，重组VP2和VP5蛋白的重组疫苗（免疫2次间隔22 d）[14]产生了较高水平的中和抗体。最近有实验用马疱疹病毒1型(EHV-1)作为BTV-8中的VP2和VP5的疫苗递送系统，结果表明，EHV-1表达BTV-8的VP2和VP5能够引发保护免疫应答[41]。目前，重组载体疫苗任处于研究阶段，虽取得了一定的成功，但仍有由许多问题待解决。

4 小 结

随着蓝舌病的分布范围的扩大和新疫情的不断出现，蓝舌病病毒的研究也在不断的加深。自2008年欧洲爆发BTV-8后灭活疫苗成为欧盟国家预防蓝舌病的首选疫苗。近几年重组疫苗成为蓝舌病疫苗的研究热点，从痘病毒到疱疹病毒，成果显著，但相对于实际应用上还有待发展。疫苗的研制离不开与病毒相关的特异性结构蛋白。BTV中的VP2、VP5、VP7等病毒蛋白，由于它们各自结构和功能上的特点，在疫苗的研制中它们表达与否和表达量的多少与疫苗的成功息息相关。对于BTV流行地区，及时的防控疫病才是关键所在。因此除了有效的接种疫苗，临床检测也至关重要。目前我国临床上用于检测蓝舌病抗体的均为国外的蓝舌病C-ELISA试剂盒，由于价格昂贵无法普及使用。针对这一难题，在国内对蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法进行研究，并已得到了较好的成果，实验显示该检测方法与中和试验检测结果符合率达100%，与进口试剂盒符合率为96.7%[43]。这将对国内蓝舌病的检测效率有一个很大的提升。因此开发研制可推广应用的测试剂盒，对流行地区的易感家畜及野生动物及时进行检测，才能遏制疫病的扩散，减少经济损失。

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Research Progress of Protein Structures and Vaccines of Bluetongue Virus

ZHANG Ling1,2,WANG Yu1,2, GU Wen-xi1, SHI Bao-xin1，YI Xin-ping1，YAO Gang2, YE Feng1, MA Xiao-jing1, ZHONG Qi1*
(1.Veterinary Institute, Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi 830000, China;
2.College of Animal Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China)

Bluetongue(BT), a zoonotic disease reported by the OIE, led to a serious threat for global animal husbandry. It has been shown that vaccination can effectively prevent the disease. Bluetongue virus(BTV)a ring virus from reovirus families, spreads through insect vectors(Culicoides)that bites cattle, sheep, deer and other susceptible ruminants. It causes hemorrhagic diseases of susceptible animals. BTV contains 10 doublestrand RNA fragments that encode seven structural proteins(VP1 ~ VP7)and five non-structural proteins(NS1, NS2, NS3, NS3α and NS4). Within double capsid proteins in BTV, the coat protein, VP2 and VP5, is BTV type-specific antigen, while the capsid protein, VP3 and VP7, contains BTV group specific epitopes. The current study summarizes the research progresses of structures and functions of BTV proteins, and different types of vaccines including attenuated vaccines, inactivated vaccines, virus-like particle and recombinant vaccines.

Bluetongue virus; viral protein; vaccine

S852.65

A

1003－6377（2015）03－0017-07

公益性行业（农业）科研专项“重要牛羊虫媒病毒病防控关键技术研究与应用”(201303035)

张玲(1990-），女，在读硕士，主要从事虫媒病的研究。

E-mail：1459760360@qq.com

钟旗（1964-），女，研究员，博士，主要从事病原微生物的研究。

E-mail：yyyzqok@yahoo.com.cn

2014-12-14，