两种检测方法对牛环形泰勒虫病感染的调查

两种检测方法对牛环形泰勒虫病感染的调查

何晓东，伊春阳，杨红霞，郭庆勇*，巴音查汗*
（新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

为进一步了解新疆托克逊县某地各年龄段牛环形泰勒虫病的感染情况，本实验应用血液涂片法和PCR检测法分别对随机采集的104头份牛全血进行了对比检测，并分析了4个年龄段牛环形泰勒虫病的感染情况。结果表明，104头份牛全血涂片染色镜检的阳性率为51.0%（53/104），PCR方法检测阳性率为57.7%（60/104）,PCR的检测阳性率高于全血涂片染色结果；该地四个年龄段牛，1~2岁龄牛环形泰勒虫病的感染率高于其它三个年龄段，感染率为72.7%（8/11）。

牛环形泰勒虫病；检测方法；感染率

修回日期：2015-03-18

牛环形泰勒虫病是由携带该病原的蜱叮咬和感染牛所致的一种原虫病[1]。该病以高热、贫血、出血、消瘦和体表淋巴结肿胀为特征，常引起牛致死性白细胞增殖紊乱[2]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须通过的动物疫病。牛环形泰勒虫的传播媒介为璃眼蜱，在新疆分布较广，所携带的病原感染牛导致泰氏焦虫病。该病常见、多发，是每年防控的重要寄生虫病。王振宝等[3]在2012年建立了该病的PCR诊断方法，对新疆疫区的牛进行过调查。有学者报道，新疆某些疫区该病发病率高达100%，死亡率达60%[4-5]。本实验对托克逊县某地采集的104血样分别进行了全血涂片镜检和PCR检测，对两种检测方法的检测结果进行了对比，并对不同年龄组的感染率进行了分析，初步了解了该地牛环形泰式焦虫病的感染现状。

1 材料与方法

1.1样品来源

2014年5月5日随机采自新疆吐鲁番地区托克逊县夏乡南湖村的104头不同年龄段牛，同时记录牛只的编号、年龄。

1.2血液涂片检查

取已标记好的干净载玻片，用移液枪取适量血液滴在载玻片上，用推片使其形成扇形的薄膜，即为理想涂片。待涂片自然晾干后用甲醇浸润整个血涂片，用稀释好的姬姆萨尔染液对晾干涂片染色2~3 min。染色结束后，将涂片用蒸馏水冲洗至淡粉色，多余水分自然晾干，置显微镜下，用油镜镜检。

1.3 PCR检测法

1.3.1 设计引物

参考Christine D’Oliveira等[6]报道设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其中，环形泰勒虫的上游引物为5′-GTAACCTTTAAAAACGT-3′；下游引物为：5′-GTTACGAACATGGGTTT-3′。扩增的特异性片段长为721bp。

1.3.2 PCR反应体系、反应条件及产物检测

PCR扩增试剂均购自上海生工有限公司。PCR扩增的反应体系为：总体积25 μL，其中Mix12.5 μL，上、下游引物(umoL/L)各1 μL，DNA模板2 μL，灭菌去离子水加8.5 μL。PCR扩增条件：94℃变性5 min,35个循环扩增(94℃，30 s；56℃，45 s；72℃，1 min)，72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.4不同年龄段牛感染环形泰勒虫情况比较

分别统计0～6月龄、7～12月龄、1～2岁、3岁以上牛环形泰勒虫的感染率情况，通过数据对比了解不同年龄段牛对环形泰勒虫的感染现状。

2 结果与分析

2.1血液涂片染色镜检

104份血液涂片镜检结果显示，有53头牛发现了圆点状或戒指状的虫体（图1），即环形泰勒虫，感染率为51.0%。

2.2 PCR检测

对提取的104份牛血液DNA样品进行了PCR检测，60份呈现阳性，感染率为57.7%，阳性样品扩增产物为721 bp，与预期条带相符（图2）。

2.3不同检测方法及不同年龄段牛感染环形泰勒虫情况比较

检测结果显示，PCR检测的感染率为57.7%，血液涂片检查的感染率51%，表明PCR的检出率高于血涂片检出率（表1）。所检测的104份样品中，73份有年龄标记。其中，0～6月龄21份、7～12月龄12份、1～2岁11份、3岁以上的样品29份，其感染率分别为57.1%、66.7%、72.7%、58.6%，实验结果表明1～2岁的牛对环形泰勒虫病的感染率最高，为72.7%（表2）。

表1 牛环形泰勒虫PCR检测和血液涂片检查结果比较

图1 牛血液图片检测结果

图2 部分血液样品牛环形泰勒虫PCR检测结果

表2 不同年龄牛环形泰勒虫病的感染情况

3 讨论

蜱作为牛环形泰勒虫病的传播媒介，是造成该病流行的主要原因。新疆吐鲁番盆地属暖温带干旱荒漠气候，夏季气候炎热，极端最高气温为48℃，这为蜱虫的孳生提供了良好的环境[7]。沙塔尔·卡哈尔等[8]曾在2013年也对吐鲁番部分疫区的126头份疑似病例进行了采集检测，PCR检测的阳性率为51.6%，血涂片染色镜检的阳性率为47.6%，两种方法检测的其感染率均低于本次的检测结果，但也显示PCR检测阳性率高于血涂片染色镜检。

从实验结果可以看出，PCR检测方法较血涂片方法检出率高，但多数的基层兽医部门由于技术和设备的限制，目前仍在使用血液涂片法。血液涂片检测在制片染色方面要求较高，镜检观察也需要一定的经验，否则容易出现漏诊和误诊，降低了该病的检出率。

通过血液涂片和PCR方法进行检测显示，新疆吐鲁番托克逊县夏乡南湖村牛环形泰勒虫病的感染情况不容乐观。建议该地畜牧兽医部门要加强牛环形泰勒虫病防控工作。在每年早春季节要对辖区的牛用环形泰式焦虫苗进行免疫注射；同时加强对养牛户牛焦虫病诊断、防治的技术培训，储备用于牛焦虫病治疗的药物制剂，最大限度的降低该病所造成的损失。

[1]简子健,马素贞,孙其喆,等.新疆牛环形泰勒虫虫病的流行病学调查[J].新疆农业科学,2011,(08):1509-1513.

[2]Schnittger L, Katzer F，Biermann R, et al. Characterization of polymorphic Theileria annulata surface protein(TaSP)closely related to PIM of Theileria annulata:Implications for use in diagnostic tests subunit vaccines[J].Mol biochem Parasit,2002,120(2):247-256.

[3]王振宝,刘启生,哈森,等.牛环形泰勒虫虫病二温式PCR诊断方法的建立及初步应用[J].动物医学进展, 2012,33(5):59-63.

[4]米日古丽·木拉提.改良牛泰勒焦虫病的调查及诊治[J].农村科技,2004,(05):14.

[5]曹雯丽,陈亮,刘启生,等.新疆牛环形泰勒虫病的流行现状和防治[J].草食家畜,2011,(03):76-78.

[6]Christine D, Oliveira, Marjo Van Der Weide, Miguel A, et al.Detection of the protozoan parasite theileria annulata in Hyalomma ticks by the polymerase chain reaction[J]. Journal Of Clinical Microbiology, 1995,33(10):2665-2669.

[7]阿尔孜古力·艾乃都,郭彦军.新疆托克逊县草地资源概况及利用对策[J].草原与草坪,2012,(01):87-96.

[8]沙塔尔·卡哈尔,曹雯丽,张扬,等.吐鲁番部分疫区牛环形泰勒虫病流行病学调查[J].新疆农业科学, 2013,(06):1161-1164.

Investigation of Two Detection Methods on the Infection of Cattle Theileria Annulata

HE Xiao-dong，YI Chun-yang，YANG Hong-xia，GUO Qing-yong*，BAYINCHAHAN*
（College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052，China）

The blood samples of 104 cattle in four aging groups were detected to identify the infection of Theileria annulata. The results by blood smear microscope and PCR demonstrated an infection rate of 51.0%(53/104)and 57.7%(60/104), respectively. Furthermore, a much higher infection rate(72.4%; 8/11)was observed among cattle at 1-2 years old.

theileria annulata; cattle; detection method; infection rate

S852.7

B

1003－6377（2015）03－0047-04

新疆高校科研计划重点项目（XJEDU2013I18）

何晓东（1990-），男（回族），硕士在读。E-mail:1498730319@qq.com

郭庆勇（1973-），男，副教授，硕导，研究方向为兽医临床寄生虫病防治。

E-mail:wlmqgqy@126.com巴音查汗（1964-），女（蒙古族），教授，博导，研究方向为预防兽医学。

2015-02-05,

E-mail: bynch@hotmail.com