堇叶碎米荠硒蛋白的体内抗氧化作用研究

雷红灵,方响亮，周大寨

(湖北民族学院 生物科学与技术学院，生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

堇叶碎米荠硒蛋白的体内抗氧化作用研究

雷红灵,方响亮，周大寨

(湖北民族学院 生物科学与技术学院，生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

【目的】 探讨富硒植物堇叶碎米荠硒蛋白的生理活性，为富硒植物的深度开发利用提供依据。【方法】 以从湖北恩施富硒植物堇叶碎米荠叶片中提取的硒蛋白作为硒来源，设置硒质量浓度分别为2.25，4.45，8.90，17.79 μg/mL的硒蛋白液灌胃饲喂小鼠4周，研究不同的硒蛋白溶液对小鼠体质量、血硒水平、血液和肝组织总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量的影响。【结果】 硒蛋白液的硒质量浓度为8.90 μg/mL时，小鼠体质量增加最多；在本试验条件下，小鼠血硒水平随硒质量浓度的增加而升高；硒质量浓度为4.45～17.79 μg/mL的硒蛋白液可明显提高小鼠血液及肝组织的T-AOC、SOD活性和GSH-Px活力，抑制MDA的生成，但硒质量浓度为8.90～17.79 μg/mL时，促进效应减缓。【结论】 堇叶碎米荠硒蛋白可以促进小鼠的生长及抗氧化能力，最适硒质量浓度为8.90 μg/mL。

堇叶碎米荠；硒蛋白；血硒；抗氧化作用

硒是人和动物必需的微量元素，它具有抗氧化、抗肿瘤、解毒重金属以及增强机体对病毒感染的免疫力等功能[1-2]，但是硒在有益和致毒之间的剂量差异很小。甘璐等[3]研究表明，补硒量为20 μg/kg 的大鼠，其机体内的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量降低，同时超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH- Px)活性升高，而补硒量为40，80 μg/kg 的大鼠，其体内MDA 含量增加，CAT、GSH-Px 和硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase，TR)活性降低，同时伴随着TR mRNA 表达水平降低，表明体内的氧化系统被激活，抗氧化系统受抑制，发生了一定程度的脂质过氧化反应，说明硒只能在一定的剂量范围内有效抑制脂质过氧化。相比无机硒，天然有机硒的毒性更低、更安全，营养更全面，生物利用度高[4-5]，因此抗氧化能力更优。罗培林等[6]研究显示，酵母有机硒比亚硒酸钠具有更高的生物学效价；李改平等[7]比较了有机硒和无机硒对小鼠全血GSH-Px 活性、肝SOD活性的影响，结果显示，有机硒能显著增强小鼠GSH-Px活性，提高SOD 活性，且硒蛋白的生物效应比硒多糖的更为明显；张劲松等[8]研究表明，烟叶硒蛋白制剂能显著提高大鼠血清GSH-Px活性，降低大鼠血清中MDA含量；烟叶的含硒Rubisco蛋白对清除自由基、防护红细胞溶血、保护化学性肝损伤的效果优于不含硒蛋白质[9]。

植物通过根部和叶片吸收的无机硒，可在体内转化成硒氨基酸、硒蛋白、硒多糖等有机形式，其中硒蛋白是最主要的存在形式。植物硒蛋白是一种高效、优良的补硒源，尤其是纯化的硒蛋白，可以作为保健品的添加剂和原料药加以利用。湖北恩施的鱼塘坝，是世界上惟一的独立硒矿床所在地，生长着一种富硒能力极强的植物——堇叶碎米荠，其苗期叶片硒含量超过1 000 mg/kg，这是在我国首次发现的超富硒植物。为了了解该植物硒蛋白的生物活性，本试验以昆明小鼠为对象，研究堇叶碎米荠叶片硒蛋白在小鼠体内的抗氧化活性，以期为该植物的深层次开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试硒蛋白从成熟野生堇叶碎米荠叶片(含硒量627.59 mg/kg，可溶性蛋白含量86.35 g/kg)中分离纯化而得，硒蛋白的含硒量为177.93 μg/g。

试验动物为SPF级昆明种小白鼠(25 g/只左右，购于湖北省预防医学科学院)，饲料由湖北省实验动物研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计 以我国推荐的人体硒最高摄入量[10]为依据，按照人与试验小鼠的换算系数(1∶9.01)及小鼠体质量，计算确定试验小鼠饲喂硒量最高为1.80 μg/(d·只)。采用随机分组法将小白鼠分为6组，每组12只，雌雄各半。适应性喂养1周后，其中1组不做任何操作(空白对照，ck1)，1组灌胃纯水(阳性对照，ck2)，另4组分别饲喂硒质量浓度为2.25，4.45，8.90，17.79 μg/mL的硒蛋白溶液，每天1次，每次0.2 mL/只。常规喂养饲料，试验期间每周称体质量1次，连续4周。

1.2.2 小鼠血清、溶血液和肝组织匀浆的制备 小鼠喂养第4周末，空腹断头处死，采血，取脏器。血液分成2份：一份不加防凝剂，静置10 min，2 000 r/min 低温离心10 min，取血清，4 ℃保存；另一份加肝素抗凝， 4 ℃冷藏备用，测试时用蒸馏水稀释50倍，制备溶血液。肝脏用预冷生理盐水漂洗，吸干水分，制备成质量分数10%的肝组织匀浆，4 ℃、2 000 r/min离心15 min，取上清液备用。

1.2.3 小鼠肝组织匀浆和血液抗氧化指标的测定 分别取质量分数10%的肝组织匀浆和血清 0.10～0.20 mL，参照南京建成生物制品公司试剂盒说明书测定以下指标。

(1)MDA含量。以四氧甲基丙烷为标准，在532 nm波长处比色，计算肝组织匀浆的MDA含量(nmol/mg)和血清的MDA浓度(nmol/mL)。

(2)总抗氧化能力(T-AOC)。37 ℃时，以每分钟每毫升血清或每毫克组织蛋白使反应体系的吸光度值增加0.01为1个总抗氧化能力单位(U)。

(3)GSH-Px活力。肝组织GSH-Px活力以催化GSH的反应速度表示，组织中每毫克蛋白质、每分钟除非酶促反应外，反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为1个酶活力单位；全血GSH-Px活力单位为，每4 μL全血在37 ℃反应5 min后，除非酶促反应外，反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为1个酶活力单位。

(4)SOD活性。以每毫升反应液中(或每毫克组织蛋白在1 mL反应液中)SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个酶活力单位(U)，即U/mg或U/mL。

1.2.4 硒和蛋白质含量的测定 硒含量的测定采用氢化物发生-原子荧光分光光度法(采用北京吉天仪器有限公司AFS-930 氢化物发生双道原子荧光光度计，硒标准液(GSB07-1253-2000)为国家环保总局标准样品研究所提供)，蛋白质含量采用考马斯亮蓝G250(进口分装)法测定。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 硒蛋白对小鼠体质量的影响

按不同处理饲喂小鼠4周后，各处理组小鼠生长发育正常，外观、行为活动、精神状态、食欲、大小便及皮毛、肤色等均未见异常。试验期间小鼠体质量变化见表1。

由表1可见，灌胃1周后，ck2及硒处理组小鼠的体质量均出现了不同程度下降，这可能是因为灌胃操作对小鼠产生了影响。饲喂2周后，各组小鼠体质量开始增加，4周后灌胃硒蛋白液各组的小鼠体质量增加率都高于对照，增加最多的是8.90 μg/mL 试验组，增加率为30.36%；17.79 μg/mL组的增加率低于另外2个低硒(2.25和4.45 μg/mL)处理组，说明硒质量浓度为17.79 μg/mL的硒蛋白液对小鼠生长的促进作用已明显减弱。

2.2 硒蛋白对小鼠血液中硒水平的影响

硒蛋白对小鼠血液中硒水平的影响见图1。

由图1可见，2个对照组小鼠血液中硒质量浓度为0.12～0.14 μg/mL，二者没有显著差异；饲喂不同硒质量浓度的硒蛋白液可以明显提高小鼠血液中的硒水平，且血液中硒水平随着饲喂硒质量浓度的增加而升高，均显著高于2个对照组，各硒处理组间也都有显著性差异，小鼠血液中硒质量浓度最高达 0.35 μg/mL。

2.3 硒蛋白对小鼠抗氧化指标的影响

2.3.1 对MDA含量的影响 不同硒质量浓度的硒蛋白液对小鼠肝组织匀浆和血清中MDA含量的影响见图2。由图2可见，小鼠肝组织匀浆和血清中MDA的含量在硒蛋白处理组与2个对照组间有显著性差异，硒蛋白处理可以降低MDA含量，并在硒质量浓度为8.90 μg/mL时抑制作用达到最大；而在硒质量浓度17.79 μg/mL时抑制作用减小，MDA含量又开始增加。

2.3.2 对T-AOC的影响 不同硒质量浓度的硒蛋白液对小鼠肝组织匀浆和血清T-AOC的影响见图3。由图3可以看出，硒蛋白处理组小鼠的肝组织匀浆和血清的T-AOC持续增加，与2个对照组有显著性差异，但硒质量浓度8.90与17.79 μg/mL 2个处理组间没有显著差异，且随着硒质量浓度的增大，小鼠肝组织匀浆和血清T-AOC的增加趋势都在减缓。血清和肝组织匀浆T-AOC(y)与血液中硒质量浓度(x)的回归方程分别为：y=83.60x-8.04,R2=0.98,P=0.006 7<0.01;y=10.37x+1.68,R2=0.98,P=0.000 1<0.01，可见，T-AOC与血液中的硒水平具有极显著相关性。

2.3.3 对GSH-Px活力的影响 由图4可以看出，硒蛋白处理组小鼠GSH-Px与2个对照组小鼠有显著性差异，且随着硒质量浓度的增加，肝组织匀浆和血液中的GSH-Px活力增强。血液和肝组织匀浆中GSH-Px活力(y)与血液中硒质量浓度(x)的回归方程分别为：y=349.77x+182.88,R2=0.98,P=0.000 1<0.01;y=159.42x+106.22,R2=0.94,P=0.000 1<0.01，可见GSH-Px活力与血液中的硒水平具有极显著相关性。

2.3.4 对SOD活性的影响 由图5可以看出，与2个对照组相比，硒蛋白处理组小鼠的肝组织匀浆和血清中SOD活性均有显著增加，但在硒质量浓度为17.79 μg/mL时，增幅下降。这与MDA含量的变化趋势一致，说明硒质量浓度17.79 μg/mL时已超过了小鼠的最适硒摄入量，所以SOD活性增幅下降，而MDA抑制作用减小，含量开始增加，但此硒摄入量仍可以提高小鼠的抗氧化能力。

3 结论与讨论

GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原调节系统中重要的含硒酶，硒参与组成其活性中心；MDA是脂质过氧化的产物之一，SOD则是体内重要的抗氧化酶，它们在清除活性氧自由基、抵抗氧化损伤、调节机体氧化还原状态等方面起着重要作用，因此可以利用生物体内这些指标的变化评价硒的抗氧化性。

关于硒蛋白的抗氧化作用，唐玫等[11]研究表明，富硒藻蓝蛋白对有机体的SOD 和GSH-Px 活性都有显著提高，特别是对肝脏GSH-Px 活性有极显著的提高作用；对堇叶碎米荠含硒蛋白的体外抗氧化研究结果显示，硒蛋白有较好的抗氧化活性[12]。本研究的结果也显示，在试验设置的硒质量浓度范围内，小鼠GSH-Px活力和T-AOC随硒质量浓度的增加而增大，且与血液中的硒水平呈极显著正相关；SOD活性也不同程度升高，MDA生成则被抑制。这些结果提示，硒蛋白提高了小鼠血液中的硒水平，促进了含硒酶的合成及活性，抑制了过氧化物的生成，提高了小鼠的抗氧化能力。

本试验中，硒质量浓度为17.79 μg/mL的硒处理组，灌胃硒量为3.56 μg/(d·只)，超出了小鼠的最大耐受硒量，该硒剂量对小鼠的生长发育及抗氧化的促进效应减小，但仍高于对照，未表现明显的毒害，这可能是因为蛋白硒以硒代半胱氨酸被吸收，在体内由密码子UGA翻译编码进蛋白质中[13-14]，其毒性效应会降低；此外，小鼠本身具有的防御机制和适应能力也可能消除该剂量硒的毒性影响。有研究表明，超营养剂量的硒摄入量可以降低动物和人类癌症的发病率[15]。本研究中小鼠体质量变化结果显示，第1周给药后，最高硒处理组小鼠体质量减少最多，除了灌胃操作影响其生长外，高质量浓度的硒溶液应该也是其影响因素，之后的体质量增加，可能与小鼠的适应机制有关。

综合来看，小鼠体质量的变化趋势与机体内抗氧化活性的变化规律存在正相关性。说明适量的堇叶碎米荠硒蛋白可以提高小鼠血液中的硒水平，促进血液及肝脏的T-AOC、GSH-Px和SOD活力；减少肝脏和血清中MDA的生成，抑制脂质过氧化，促进小鼠的生长发育。

志 谢：本研究工作得到了湖北民族学院的湖北省重点(特色)学科林学一级学科的支持，在此表示感谢！

[1] Iwona Z，Halina Z.Selenium interactions and toxicity [J].Cell Biology and Toxicology，2012,28:31-46.

[2] Flueck W T,Smith-Flueck J M,Mionczynski J,et al.The implications of selenium deficiency for wild herbivore conservation [J].European Journal of Wildlife Research,2012,58:761-780.

[3] 甘 璐，刘 琼，徐辉碧．硒对大鼠肝脏抗氧化酶活性及基因表达的影响 [J].中国公共卫生，2003，19(2):159-160．

Gan L,Liu Q,Xu H B.Effects of selenium on activities of antioxidant enzymes and gene expression in rat’s livers [J].China Public Health,2003，19(2):159-160．(in Chinese)

[4] Thiry C,Schneider Y J,Pussemier L,et al.Selenium bioaccessibility and bioavailability in Se-enriched food supplements [J].Biological Trace Element Research,2013,152:152-160.

[5] 田俊梅，张 丁，付瑞娟，等．大豆硒蛋白与亚硒酸钠生物利用的比较研究 [J].大豆科学，2010，29(3)：534-536．

Tian J M,Zhang D,Fu R J,et al.Comparison of the bioavailability of soybean selenoprotein and sodium selenite [J].Soybean Science,2010,29(3):534-536．(in Chinese)

[6] 罗培林，郑 萍，何 军，等．不同硒源及硒水平对大鼠生长性能、血清抗氧化能力和组织硒沉积的影响 [J].动物营养学报，2012,24(7)：1311-1319.

Luo P L,Zheng P,He J,et al.Different selenium sources and levels affect growth performance,serum antioxidant ability and tissue selenium retention in Wistar rats [J].Chinese Journal of Animal Nutrition,2012,24(7)：1311-1319.(in Chinese)

[7] 李改平，刘子川，王梦亮．有机硒和无机硒对小鼠抗氧作用比较研究 [J].山西中医学院学报，2001,2(3)：19-21．

Li G P，Liu Z C,Wang M L.Effects of organic selenium and inorganic selenium on biochemical criterions in mice [J].Journal of Shanxi College of Traditional Chinese Medicine,2001,2(3)：19-21．(in Chinese)

[8] 张劲松，高学云，邵玉芬，等．烟草硒蛋白质工业化提取及其对免疫调节和抗氧化作用的影响 [J].中国烟草学报，1998，4(2)：29-32．

Zhang J S,Gao X Y,Shao Y F,et al.Industrial extraction of selenoprotein from fresh tobacco leaves and its effects on immune adjustment and antioxidation [J].Acta Tabacaria Sinica,1998，4(2)：29-32．(in Chinese)

[9] 陈春英，张劲松，黄开勋,等.烟叶硒蛋白对人红细胞的辐射溶血及自由基的作用 [J].中国药理学通报,1996,12(4):357-359.

Chen C Y,Zhang J S,Huang K X,et al.Effect of seleno-protein from tobacco leaves on haemolysis of human red erythrocyte and free radical [J].Chinese Pharmacological Bulletin,1996,12(4):357-359.(in Chinese)

[10] 中国营养学会．中国居民膳食营养素参考摄入量 [M].北京：中国轻工业出版社，2000．

Chinese Nutrition Society.DRIs(Chinese dietary guide) [M].Beijing:Chinese Light Industry Press,2000．(in Chinese)

[11] 唐 玫，王 曼，郭宝江．富硒藻蓝蛋白对小鼠免疫功能及抗氧化活性的影响 [J].营养学报，2001，23(3)：275-278.

Tang M, Wang M,Guo B J.Effects of selenium-enriched phycocyanin on immune capacity in mice [J].Acta Nutrimenta Sinica,2001,23(3)：275-278．(in Chinese)

[12] Lei H L，Zhou D Z.The antioxidant activityinvitroof selenoprotein in Se-enriched plant [C].Selenium in the environment and human health.London:CRC Press,2013.

[13] Sochor J,Pohanka M，Nedecky B R，et al.Effect of selenium in organic and inorganic form on liver,kidney,brain and muscle of Wistar rats [J].Central European Journal of Chemistry，2012，10(5):1442-1451.

[14] Isabel L H,Maria P，Yolanda M.Selenoproteins:The key factor in selenium essentiality,state of the art analytical techniques for selenoprotein studies [J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2011,400:1717-1727.

[15] Clark J，Combs G，Turnbull B，et al．Effects of selenium supplementation for cancer prevention in patients with carcinoma of the skin：A randomized controlled trial [J].Nutritional Prevention of Cancer Study Group JAMA,1996，276：1957-1963．

Invivoantioxidation of selenoprotein inCardamineviolifolia

LEI Hong-ling,FANG Xiang-liang,ZHOU Da-zhai

(SchoolofBioscienceandBiotechnology,KeyLaboratoryofBiologicalResourcesProtectionandUtilizationofHubeiProvince,HubeiMinzuUniversity,Enshi,Hubei445000,China)

【Objective】 The physiological functions of selenoprotein in hyperaccumulator were investigated to improve the development and utilization of Se-rich plants.【Method】 Selenoprotein,purified from leaves ofCardamineviolifoliain Enshi,Hubei Province,was feed to Kunming mice by gastro gavage for 4 weeks.The mass concentrations of selenium in selenoprotein solution were 2.25,4.45,8.90 and 17.79 μg/mL,respectively.Physiological parameters including weight,blood selenium levels,the total antioxidant capacity,SOD,GSH-Px,and MDA in blood and liver tissue were detected.【Result】 The weight of Kunming mice increased the most when selenium mass concentration was 8.90 μg/mL.Blood selenium levels increased with the increase of selenium concentration.When the mass concentrations of selenium were 4.45-17.79 μg/mL,selenoprotein significantly enhanced the total antioxidant capacity,SOD,GHS-Px activity and inhibition on MDA formation,but the increasing rates decreased when selenium mass concentrations were 8.90-17.79 μg/mL.【Conclusion】 Selenoprotein in leaves ofCardamineviolifoliapromoted the growth and antioxidant ability of Kunming mice,and the optimum selenium mass concentration was 8.90 μg/mL.

Cardamineviolifolia;selenoprotein;blood selenium level;antioxidant activity

2013-08-20

国家自然科学基金项目(31360498)；湖北省科技计划项目(2012FFC02501)；国家民委科研项目(12HBZ008)；湖北省教育厅自然科学研究重点项目(D20131902)；湖北民族学院博士启动基金项目(MY2011B006)

雷红灵(1967-)，女，湖北鹤峰人，教授，博士，主要从事硒生理生化研究。E-mail:leihl123366@163.com

时间:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.021

Q493.99

A

1671-9387(2015)01-0201-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.021.html