青贮用乳酸菌的筛选及其生物学特性研究

侯霞霞，来航线，韦小敏

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

青贮用乳酸菌的筛选及其生物学特性研究

侯霞霞，来航线，韦小敏

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 筛选生长繁殖快、产酸能力强且耐酸的乳酸菌，以获得制备果渣青贮发酵剂的优良菌株。【方法】 通过葡萄糖发酵产酸产气特征、产酸速率和生长曲线进行供试乳酸菌的筛选，对筛选出的优良菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定，并进一步研究其生长温度范围、酸碱耐受性、耐盐性，最后对菌株发酵液进行酸度滴定和有机酸组分分析。【结果】 经筛选共获得R7、R3、Rg和Re 4 株优良乳酸菌。经形态学、生理生化和16S rDNA序列分析，确定R7为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，R3为戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)，Rg为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，Re为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)。4 株菌均可在15～50 ℃生长。菌株R7生长最快，降酸能力最强，发酵液乳酸含量最高，占总酸含量的95.40%，在pH值3.0条件下可以旺盛繁殖，同时可耐受质量浓度0.08 g/mL NaCl。Re、R3生长及产酸仅次于R7，酸碱耐受性较强。Rg在50 ℃生长良好，可耐受高温。【结论】 菌株R7、Re、R3、Rg具有生长快、产酸能力强、耐酸、产乳酸含量高等优良生物学特性，可应用于果渣青贮饲料添加剂的制备。

青贮发酵剂；乳酸菌；产酸能力

青贮饲料是反刍动物重要的粗饲料来源，发展畜牧业的主要支撑。青贮饲料是在厌氧条件下利用乳酸菌发酵产生乳酸，使青贮料pH值迅速下降，抑制其他耗氧微生物对青绿饲料营养成分的分解作用，从而使青绿饲料得以保存[1]。许多试验表明，添加乳酸菌可降低青贮饲料pH和氨态氮含量，提高乳酸含量和饲料营养价值[2-6]。由于青贮原料表面乳酸菌的数量有限，同时又混有其他微生物，要使乳酸菌尽快繁殖，原料必须有超过105CFU/g的乳酸菌[7]。青贮过程中乳酸菌必须具备活力强且达到一定数量，才能更好地发挥其生物功效。因此，筛选出生长繁殖快、产酸能力强的优良乳酸菌菌株，是制备优良青贮添加剂的核心，也是青贮成功的关键。

青贮饲料中含有丰富的乳酸菌，其中包括肠球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌、链球菌和乳杆菌等，它们在青贮饲料发酵中起重要作用。目前用于青贮的发酵菌主要有同型发酵乳酸菌，如植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、粪链球菌(Enterococcusfaecium)、片球菌(Pediococcusspp)等，以及异型发酵乳酸菌，如布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)等。何轶群等[8]从玉米秸秆青贮饲料中筛选到 6 株产酸性和抑菌性较好的优良乳酸菌，其中产酸能力最强的是植物乳杆菌。段宇珩等[9]试验表明，青贮饲料中的大多数乳酸菌为乳杆菌属(Lactobacillus)，占总数的79%以上。刘飞等[10]从青贮饲料中筛选出了产酸性能较好的2株乳球菌和2株乳杆菌。张慧杰等[11]研究表明，适温条件下乳酸杆菌的活力及生长速度均优于乳酸球菌，且筛选到 1 株产酸能力较强的植物乳杆菌。

果业加工业产生的大量果渣废弃物极易腐败，造成严重环境污染，但果渣中含有丰富的养分，可供乳酸菌生长利用，可作为优良的青贮原料。因此果渣青贮在变废为宝的同时实现了废渣的零排放，具有重大的实际意义及应用前景。然而目前，可以用作果渣青贮发酵剂的菌株研究很少，自然的青贮又不能保证青贮的品质。因此，筛选可应用于果渣青贮的优良乳酸菌非常关键。本试验通过对供试乳酸菌生长与产酸性能以及耐酸性指标的测定，筛选适用于果渣青贮的优良菌株，进一步结合传统鉴定方法与现代分子生物学手段将筛选出的乳酸菌鉴定到种，旨在获得生物学特性优良的乳酸菌，以期为果渣青贮饲料乳酸菌添加剂的研究和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试乳酸菌共有9株，其中4株为西北农林科技大学资源环境学院微生物生态研究室筛选保藏，编号分别为R1、R7、R3、Rf，可作为饲用乳酸菌制剂开发应用；5株为分离自青贮饲料的菌株，编号分别为Re、Rg、Rn、Rb、Rd。

1.1.2 培养基 MRS培养基[12]，MRS琼脂斜面培养基。

1.1.3 仪器设备 恒温培养箱、超净工作台、光学显微镜(Motic)、立式压力蒸汽灭菌锅、PCR 仪、Haier冰箱、凝胶成像仪、电泳仪、紫外分光光度计、高效液相色谱仪(waters 2695)。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的筛选 利用MRS液体培养基对9株供试菌株进行活化，再进行平板涂布，通过观察菌落形态特征以及革兰氏染色后镜检结果判断菌株是否为纯培养，同时对革兰氏阳性的杆状或球状菌株进行接触酶试验。

葡萄糖发酵产酸产气[12]：对供试菌株进行产酸产气试验，当培养基中指示剂变黄表示产酸，由颜色深浅初步判断菌株的产酸强弱。软琼脂柱内产生气泡或出现2%琼脂层向上顶的现象表示产气。

产酸速率：按1.0×107CFU/mL的接种量将供试乳酸菌接入MRS液体培养基中，37 ℃、120 r/min 振荡培养。每隔2 h采用DELTA-320 pH计测定各菌株发酵液的pH值，绘制各发酵时间段所对应的发酵液pH值的变化曲线，即为产酸速率曲线。

生长曲线：按1.0×107CFU/mL的接种量将供试乳酸菌接入MRS液体培养基中，37 ℃、120 r/min 振荡培养。每隔2 h取1次液体发酵液样品，保存于4 ℃冰箱中，最后以MRS培养基为空白，在620 nm下测定样品的吸光值，以培养时间为横坐标，相对应的吸光值为纵坐标，绘制乳酸菌生长曲线。

1.2.2 乳酸菌的鉴定 形态学鉴定[13]：将筛选获得的菌株分别涂布到MRS固体培养基，37 ℃培养1～2 d，观察菌落特征，取典型菌落涂片，进行革兰氏染色，油镜下观察菌体形态，拍照。

生理生化鉴定[13]：包括石蕊牛奶、淀粉水解、精氨酸水解、精氨酸产氨、明胶液化、产H2S、马尿酸钠水解、葡聚糖产生、硝酸盐还原、V-P试验、M-R试验、运动性、pH 6.5、pH 4.5，以及菌株对阿拉伯糖、纤维二糖、卫矛醇、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘油、肌醇、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、棉籽糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、山梨醇、山梨糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、木糖、可溶性淀粉等22种碳水化合物发酵产酸试验。

16S rDNA序列分析[14]：提取供试乳酸菌的DNA，利用细菌通用引物进行PCR扩增与序列测定，将测得的16S rDNA序列结果按要求输入GenBank中进行序列检索比对，获得与已知序列微生物的相似性，从而确定供试乳酸菌的属种信息。

1.2.3 乳酸菌生物学特性测定 温度耐受性试验：将活化的乳酸菌按体积分数6%接种量接入MRS液体培养基，分别置于10，15，18，37，45，50，60 ℃温箱，每组设3个重复，恒温培养24 h，取样测定各组菌液的OD620 nm值。

耐酸碱试验：用无菌HCl和NaOH调MRS液体培养基pH至3.0，4.0，4.5，6.5，8.0，9.0，9.5，将活化的乳酸菌按体积分数6%接种量接入不同pH值的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养24 h，取样测定各组菌液OD620 nm值。

耐盐性试验：将活化的乳酸菌按6% 接种量接入含有质量浓度为0，0.03，0.04，0.065，0.08，0.12，0.15 g/mL NaCl的MRS液体培养基，37 ℃恒温培养24 h，取样测定各组菌液OD620 nm值。

产酸量测定：采用酸碱滴定法[15]，每隔2 h取乳酸菌的培养液，用0.1 mol/L NaOH 溶液滴定，推测产酸量。产酸量以吉尔涅尔度(°T)表示，即每100 mL培养液消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液记为1 °T。指示剂为质量浓度10 g/L酚酞。

有机酸测定[16]：通过高效液相色谱法进行乳酸菌发酵液产酸组分分析，筛选出组分单一，乳酸含量高的菌株。将乳酸菌发酵液在3 000 r/min离心20 min，将上清液经0.45 μm的微孔滤膜过滤后备用。利用waters的HPLC 2695测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。流动相为0.5%(NH4)2HPO4(用磷酸调pH为2.55)，流速2 mL/min；色谱柱C18，柱温70 ℃；检测波长UV 214 nm。

2 结果与分析

2.1 供试菌株的特性

通过平板培养和镜检观察，9株供试菌菌落皆为白色，圆形，菌体呈杆状或球状。革兰氏染色呈阳性，接触酶试验呈阴性，供试菌株特性详见表1。

注：“G+”表示革兰氏染色呈阳性。

Note:“G+” denotes gram positive.

2.2 优良乳酸菌筛选结果

2.2.1 葡萄糖发酵产酸产气试验 以R1、R7、R3、Rf、Re、Rg、Rn、Rb、Rd作为供试菌株，进行葡萄糖发酵产酸产气试验，结果见表2。由表2可以看出，菌株R7、R3、Re、Rg产酸能力较强，R1、Rf产酸能力次之；菌株R1、Rg产气。因此，R7、R3、Re、Rf为同型发酵乳酸菌，R1、Rg为异性发酵乳酸菌。故筛选出6株产酸相对较强的乳酸菌(R7、R3、Re、Rg、R1、Rf)用于后续试验。

注：“-”表示不能够产酸或产气；“+” 、“++” 、“+++”表示产酸或产气能力依次增强。

Note:“-”denotes no acid or gas;“+” ,“++” ,“+++”denotes the ability of acid or gas production enhanced gradually.

2.2.2 产酸速率及生长曲线 将葡萄糖产酸产气试验中获得的 6 株乳酸菌进一步进行生长和产酸情况研究，其产酸速率和生长曲线见图1和图2。

产酸速率是筛选优良乳酸菌的重要指标，不同菌株之间差异较大。由图1可以看出，6株菌的pH值变化趋势一致，随着培养时间延长，pH值逐渐下降。pH值在0～2 h变化不明显，菌株处于适应期，2 h以后pH值下降较快，说明乳酸菌进入对数生长期，菌体生长代谢速度加快，20～36 h变化趋于平缓，表明菌株进入稳定期，代谢减慢。方差分析结果表明，不同乳酸菌菌株的pH值变化差异极显著(F=17.42>F0.01=3.31)；不同培养时间pH值变化差异也极显著(F=48.42>F0.01=2.42)。根据方差分析的结果对不同菌株、不同时间的pH值进行多重比较，结果表明R7、Rg、R3、Re这4株乳酸菌pH值下降较快，且这4株菌间差异不显著。

由图2可以看出，菌体在 6～18 h生长最快，与图1中pH值迅速下降的时间段相对应，且对数生长期较长，可使菌株在较长时间保持较高的活力，说明菌株具有较强的繁殖力，在这个时期产酸量也最高。方差分析结果表明，不同乳酸菌菌株的OD值差异极显著(F=18.20>F0.01=3.31)，不同培养时间OD值差异也极显著(F=80.50>F0.01=2.42)。根据方差分析的结果对不同菌株、不同培养时间的生长状况进行多重比较，结果表明，R7、Rg、R3、Re这4株乳酸菌生长性能较好，对数生长期长，且菌株间差异不显著。

综合供试乳酸菌的产酸速率和生长曲线结果可以看出,菌株R7、Rg、R3、Re生长性能和产酸能力均较好。

2.3 优良乳酸菌鉴定结果

2.3.1 形态学鉴定结果 将筛选获得的R7、Rg、R3和Re 4株优良乳酸菌经MRS平板培养，获得的菌落皆为圆形、白色、奶油状，边缘整齐、黏稠、不易挑取。通过显微镜观察发现，4株乳酸菌皆为杆状，单个、成对或链状排列，其菌落特征和菌体形态特征见图3。

2.3.2 生理生化鉴定结果 对筛选获得的4株乳酸菌R7、Re、Rg和R3进行碳源利用方式及生理生化指标鉴定，结果见表3和表4。由表4可见，筛选获得的 4 株乳酸菌无芽孢，革兰氏阳性，不能够液化明胶，不水解淀粉，不还原硝酸盐，不产生H2S，耐酸性能好，在pH 6.5时生长良好，在pH 4.5时仍可生长，且无运动性。结合表3乳酸菌对碳水化合物的利用方式，初步鉴定为乳杆菌属的细菌。

2.3.3 16S rDNA鉴定结果 将供试乳酸菌测序结果输入GenBank对比，结果表明，R7与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)具有100%的相似度，Rg与发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)具有98%的相似度，Re与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)具有100%的相似度，供试乳酸菌R3与戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)具有99%的相似度。

结合以上 4 株菌的镜检及菌落形态特征、生理生化和16S rDNA分析结果，确定R7为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，R3为戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)，Rg为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，Re为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)。

注：“-”表示结果呈阴性；“+”表示结果呈阳性；“++”表示结果呈较强阳性；“+++”表示结果呈强阳性。表4同。

Note:“-”denotes negative;“+”denotes positive;“++”denotes stronger positive;“+++”denotes the strongest positive.The same table 4.

2.4 乳酸菌生物学特性测定结果

2.4.1 温度耐受性、耐酸碱和耐盐性 由图4可以看出，各菌株OD值均比初始值要高，其生长温度为15～50 ℃，10 ℃和60 ℃时乳酸菌基本不生长。37 ℃时OD值最大，为乳酸菌生长最适温度。进一步分析发现，Rg相较其他菌株在50 ℃生长良好，说明Rg具有较强耐受高温的能力，Re次之。由图5可知，多数菌株在酸性条件下生长较碱性条件好，但培养基pH值太高或太低均不利于乳酸菌生长。各菌株在pH 6.5时OD值最大，说明pH 6.5为各菌株的最佳培养条件。R7、Rg、R3、Re在pH 3.0，4.0和4.5时OD值均较初始值高，说明4株菌均有较强的耐酸能力；Re在各种条件下均生长较好，说明Re具有较强的耐受酸碱的能力。由图6可知，随着NaCl质量浓度增加各菌株生长减弱。Rg和Re在0.08 g/mL NaCl的培养基中生长较弱，R7和R3在含0.08 g/mL NaCl的培养基中较初始值显著增高，除R7菌株外，其余菌株在含0.12 g/mL NaCl的培养基中基本不再生长，说明R7有较强的耐盐能力。

2.4.2 产酸量 对4株乳酸菌不同培养时间的培养液进行酸度测定，结果见图7。酸度从总体上反映了乳酸菌产酸能力的大小。由图7可知，4 株乳酸菌酸度的变化趋势一致。随着培养时间增加，产酸总量呈上升趋势，2～8 h产酸量迅速增加，产酸量高的时间段为 8～36 h，同时也是乳酸菌的对数生长期和稳定期。酸度反映了菌株产酸总量的变化情况。从图7可以看出，菌株R7、Rg、R3、Re产酸性能均较好，尤其是R7产酸量一直处于最高，24 h酸度达到146.4 °T。

2.4.3 有机酸组分 通过高效液相色谱对乳酸菌发酵产酸情况进行定性和定量分析，结果待测菌株均在 2.438 min出峰，其相对含量结果见表5。由表5 可知，待测菌株经液体发酵后均产生乳酸。R7、Rg、R3和Re 4株菌均无丁酸产生，丙酸相对含量较低。菌株R7乳酸相对含量最高，为95.40%；菌株R3乳酸相对含量也较高，为81.93%；菌株Rg乳酸相对含量为77.56%；菌株Re有乙酸产生，乳酸和丙酸相对含量之和所占比例较高，达到 86.44%。由此可以得出，菌株R7、Re、R3、Rg产酸相对单一且乳酸含量较高，与pH值及酸度测定结果一致。

3 讨 论

青贮是一种很好的饲料利用方式，可通过乳酸菌的增殖，将原料中的可溶性糖转化成乳酸等酸类物质，创造酸性环境，抑制有害微生物的增殖，从而保存青贮饲料中的营养成分，达到饲料长期贮存的目的[17]。然而，新鲜饲草表面只有极少量乳酸菌，但附着了大量的腐败菌、丁酸菌、霉菌等有害菌。青贮开始时依靠青贮料自身的少量乳酸菌短时间内不能形成优势菌群，而腐败菌大量繁殖占据优势地位，消耗营养物质，容易产生霉菌毒素和二次发酵。因此，简单的自然青贮不能满足发酵的要求，分离筛选优质的乳酸菌就显得非常重要。本研究结果表明，菌株R7、Rg、R3、Re具有生长快、产酸能力强、耐酸的特性，经传统鉴定方法及16S rDNA序列分析，R7为植物乳杆菌，R3为戊糖乳杆菌，Rg为发酵乳杆菌，Re为鼠李糖乳杆菌。这与张慧杰等[11]的研究结果适温条件下乳酸杆菌的活力及生长速度均优于乳酸球菌相一致。

青贮要求在较短时间内青贮基质pH值迅速下降到4.0以下，这样才能有效抑制真菌及其他杂菌的生长。因此，产酸速率及快速生长能力是筛选优良乳酸菌的重要指标。McDonald等[1]和Woolford[18]提出，用于青贮菌制剂的微生物应具有均一发酵途径，可快速发酵乳糖产生最大量的乳酸，能发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、果聚糖，尤其是戊糖，有耐酸能力，能快速降低pH值，至少使pH值最终达到4.0，以抑制其他微生物。本研究结果表明，菌株R7、Rg、R3、Re生长及产酸能力俱佳，尤其是R7，在16 h可使发酵液pH值降至3.64，24 h酸度达到146.4 °T；其他菌株在发酵24 h后 pH值分别为3.61，3.65和3.67，且 4 株菌对数生长期较长。菌株R7、Rg、R3、Re在pH 3.0，4.0，4.5时均可旺盛生长，说明这 4 株菌都具有较强的耐酸能力，由于果渣本身pH值较低，因此筛选耐酸的菌株更有利于果渣青贮。

有机酸的含量及组成比例是确定青贮饲料发酵特性和评价青贮饲料品质的重要指标。青贮饲料质量的好坏取决于乳酸菌作用，乳酸是乳酸菌的主要产物，其含量是反映青贮饲料质量最重要的指标。乙酸的生成量与青贮饲料品质呈负相关[19]。丙酸可以抑制真菌繁殖，防止二次发酵。丁酸由酪酸菌产生，可直接反映青贮饲料的腐败程度[20]。因此，选择乳酸、乙酸、丙酸和丁酸作为主要分析对象。利用高效液相色谱对菌株R7、Rg、R3、Re的发酵液进行分析发现，菌株R7乳酸含量最高，相对含量为95.40%，菌株R3、Rg、Re发酵液乳酸相对含量分别为81.93%，77.56%，48.18%。菌株Re产生的丙酸可以有效抑制真菌繁殖。由此可以得出，菌株R7、Re、R3、Rg具有均一的发酵途径，能发酵产生大量乳酸，可作为制备青贮发酵剂的优良菌株。近年来的研究表明，同型发酵乳酸菌与异型发酵乳酸菌混合使用更有利于养分保存和有氧条件下品质稳定，虽然异型发酵乳酸菌乳酸转化效率较同型发酵乳酸菌的差，但异型发酵时产生大量乙酸，乙酸具有抗真菌的作用，对防止有氧腐败至关重要[21-23]。这些规律可为果渣青贮发酵菌剂的研究和应用提供参考依据。菌株R7、Re、R3、Rg是否可以作为添加剂菌种还需要小规模发酵试验来验证,还有待进一步深入研究。

4 结 论

1)本研究以实验室保藏的具有饲用价值的乳酸菌和青贮饲料中分离到的菌株为出发菌，通过葡萄糖发酵产酸产气特征、产酸速率和生长曲线等试验，筛选出4株生长、产酸能力俱佳的菌株R7、R3、Re和Rg。

2)对筛选获得的菌株经传统的形态学、生理生化指标及16S rDNA序列分析，确定R7为植物乳杆菌，R3为戊糖乳杆菌，Rg为发酵乳杆菌，Re为鼠李糖乳杆菌。

3)生物学特性研究发现，R7、R3、Re和Rg 4 株菌均可在15～50 ℃较好生长，且具有良好的耐酸耐碱性。R7和R3具有较强的耐盐能力，Rg可耐受50 ℃高温。菌株R7、Re、R3、Rg产酸单一且乳酸含量较高。这4株菌均有制备优良果渣青贮发酵剂的潜能，可用于进一步研究。

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Screening of lactic acid bacteria strains and their biological characteristics

HOU Xia-xia,LAI Hang-xian,WEI Xiao-min

(CollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to screen acid bacteria strains for pomace silage additive usage which grow fast and have strong acid production capacity and acid tolerance.【Method】 The tested strains were screened based on acid and gas production characteristics,acid production rate,and growth curve in glucose fermentation.The selected strains were identified through morphological observation,physiological and biochemical tests,and 16S rDNA sequence analysis.We further studied the growth temperature range,acid and alkali resistance,salt resistance,acidity,and organic acids components of selected strains.【Result】 Four lactic acid bacteria strains,R7,R3,Rg,and Re,were screened.Through morphological observation,physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis,R7 wasLactobacillusplantarum,R3 wasLactobacilluspentosus,Rg wasLactobacillusfermentum,and Re wasLactobacillusrhamnosus.All the strains can grow at temperatures between 15 to 50 ℃.Strain R7 grew fastest and had the strongest acid produce capacity.Its lactic acid content was also the highest,accounting for 95.40% of the total acid content.It grew well with pH of 3.0 and can tolerate NaCl with mass concentration of 0.08 g/mL.The growth and acid productions of Re and R3 were less than that of R7,and they also had strong acid and alkali resistance.Rg grew well at temperature of 50 ℃,showing strong high temperature tolerance.【Conclusion】 Strains R7,Re,R3 and Rg showed good biological characteristics including fast growth,strong acid production capacity and acid tolerance,and high lactic acid content,and they can be applied to the preparation of pomace silage additives.

silage fermentation agent;lactic acid bacteria;acid-production performance

2013-09-13

国家科技支撑计划项目(2012BAD14B11)；国家“十二五”科技支撑计划项目“果渣饲料化生产技术集成及产业化”(K303021204)

侯霞霞(1989-),女，内蒙古呼和浩特人，在读硕士，主要从事微生物资源与利用研究。E-mail:houxia1989@126.com

来航线(1964-)，男，陕西礼泉人，副教授，博士，主要从事微生物生态和微生物资源与利用研究。 E-mail:laihangxian@163.com

时间:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.019

S816.6；TQ920.1

A

1671-9387(2015)01-0183-10

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.019.html