次级淋巴组织趋化因子在溃疡性结肠炎中的表达及其意义*

次级淋巴组织趋化因子在溃疡性结肠炎中的表达及其意义*

高东锋#周国雄曹维陈海琴张海峰&

南通大学附属医院消化内科(226001)

*基金项目：南通市应用研究计划项目(BK2012074)

#现工作单位：陕西省咸阳市中心医院消化内科 (712000)，Email: 2293885415@qq.com

背景：次级淋巴组织趋化因子(SLC)参与淋巴归巢和抗肿瘤免疫应答，对肠道淋巴细胞有趋化作用。多项动物实验表明SLC参与了溃疡性结肠炎(UC)的发生、发展。目的：探讨SLC在UC患者中的表达及其意义。方法：纳入2010年12月-2012年12月南通大学附属医院40例活动期UC患者，以20名健康志愿者作为正常对照，采用免疫组化法检测结肠组织SLC表达，并分析其与UC病情程度的关系。结果：UC组SLC均阳性表达，正常对照组呈阴性或弱阳性表达，UC组SLC表达显著高于正常对照组，差异有统计学意义(4.16±0.78对0.52±0.11，P<0.05)。UC病变程度越重，SLC表达阳性率越高。结论：SLC参与了UC的发生和发展，其可能在UC局部结肠组织破坏和病理变化中起重要作用。

关键词结肠炎，溃疡性；次级淋巴组织趋化因子；免疫组织化学

多项研究结果证实次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid tissue chemokine, SLC)及其受体CCR7在溃疡性结肠炎(UC)中表达升高，参与了UC的发病，但具体机制尚不明确。SLC属于CC类趋化因子，是第一个被证实参与体内淋巴细胞归巢的趋化因子。CCR7是SLC的受体，属于G蛋白偶联的7次跨膜受体超家族。SLC需与CCR7结合方能发挥其多数生物学作用，且作用的强弱与CCR7表达水平密切相关。SLC可趋化T细胞、B细胞、活化的自然杀伤细胞(natural killer cell, NK细胞)以及树突细胞(dendritic cell, DC)至外周淋巴组织或器官，在UC的发生和进展中起重要作用。多项动物实验[1-5]表明SLC参与了UC的发生、发展。本研究通过免疫组化法检测SLC在UC患者中的表达情况并分析其与病情程度的关系，旨在了解SLC在UC发病中的作用。

对象与方法

一、研究对象

收集2010年12月-2012年12月南通大学附属医院经内镜和病理检查证实为UC的门诊和住院患者40例，诊断符合2000年成都全国炎症性肠病学术会议研讨会制定的UC诊断标准[6]。其中男21例，女19例，年龄20~69岁(中位年龄46岁)；所有患者均为疾病活动期，按Truelove Witts标准进行病情程度分级：轻度12例，中度18例，重度10例；病变累及部位：直肠炎8例，直乙状结肠炎12例，左半结肠炎18例，全结肠炎2例。取同期性别、年龄相匹配的20名健康志愿者作为对照，其中男10名，女10名，年龄25~65岁(中位年龄40岁)。本研究方案获得南通大学附属医院医学伦理委员会批准，获取标本时取得患者知情同意。

二、标本采集

所有研究对象常规作肠道准备，然后行结肠镜检查，UC患者在病变最明显处取组织2块，健康志愿者取正常肠黏膜2块。所得标本立即置于4%甲醛溶液中固定。制备组织切片，部分切片行HE染色，光学显微镜下评价炎症、溃疡等组织学改变；另一部分用于检测SLC的表达。

三、免疫组化

采用LabVision公司的2D全自动免疫组化染色仪，行EnVision二步法染色。兔抗人SLC多克隆抗体(购自Abcam公司)的工作浓度为 1∶100，羊抗兔二抗(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)工作浓度1∶100。所有切片均在同一条件的光学显微镜下观察，每张切片随机计数至少10个400倍视野，结果以细胞核或细胞质呈棕黄色或褐色颗粒状物者为阳性细胞，阴性对照为无棕黄色反应产物。SLC表达以染色强度与阳性细胞数之积表示，染色强度：0分，阴性染色；1分，弱阳性染色；2分，中度阳性染色；3分，强阳性染色。阳性细胞数：0分，阴性；1分，阳性细胞数占1%~25%；2分，阳性细胞数占26%~50%；3分，阳性细胞数占51%~75%；4分，阳性细胞数占76%~100%。

四、统计学分析

结果

正常对照组结肠黏膜上皮完整，未见糜烂、溃疡，黏膜和黏膜下层可见少量炎症细胞浸润，固有层腺体形态正常、排列整齐；UC患者结肠黏膜上皮损伤、缺失，糜烂和溃疡形成明显，黏膜和黏膜下层可见密集分布的淋巴细胞和单核细胞浸润，固有层腺体变形、排列紊乱(图1)。正常对照组结肠黏膜组织中SLC呈阴性或弱阳性表达，UC组SLC均阳性表达(图2)。UC患者结肠SLC表达较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(4.16±0.78对0.52±0.11，P<0.05)；轻、中、重度UC患者结肠黏膜SLC表达(2.72±0.52、4.22±0.88、5.98±1.10)均较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。中、重度UC患者结肠黏膜SLC表达与轻度UC组相比差异有统计学意义(P<0.05)；重度UC患者结肠黏膜SLC表达与中度UC相比差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

A：正常对照组；B：UC患者

图1正常对照组和UC患者结肠组织病理检查结果(HE染色，×200)

A：正常对照组；B：UC患者

图2正常对照组和UC患者结肠组织中SLC表达(免疫组化 染色，×400)

表1　正常对照组和UC患者中SLC的表达±s)

*与正常对照组比较，P<0.05；#与轻度UC组比较，P<0.05

讨论

当UC发病时，在各种因素的作用下，一方面肠道SLC表达增高，通过浓度梯度吸引CCR7阳性淋巴细胞向淋巴结迁移；另一方面机体的淋巴细胞数量、淋巴细胞表面的CCR7表达亦明显增加，两者共同诱导多种淋巴细胞归巢，促进抗原呈递细胞如T细胞、B细胞在淋巴结中聚集、活化、分化等[7-12]。Kawashima等[13]通过分析肠样本发现SLC散在分布于肠内淋巴结、集合淋巴管和淋巴管，肠系膜淋巴结SLC高表达于高内皮小静脉、淋巴管和间质DC，尤其在T细胞区域。与UC相比，克罗恩病肠系膜淋巴结中SLC、ELC和CCR7 mRNA表达明显增多，主要高表达于高内皮小静脉、成熟DC和淋巴管，引起T细胞异常增殖。SLC、ELC和CCR7的相互作用促进了Th1免疫反应，克罗恩病中记忆T细胞和成熟DC可能归巢至肠系膜淋巴结。

多项实验性结肠炎大鼠模型研究[1-3]表明，正常大鼠结肠少量表达SLC，主要表达于黏膜下层，可能与肠壁淋巴组织的发育、正常运动有关。SLC mRNA表达较对照组明显增高，结肠炎大鼠结肠黏膜下微血管区、淋巴结和派氏集结区的高内皮小静脉SLC强表达，同时亦可见肠黏膜下淋巴细胞的异常归巢，SLC抗体干预后炎症病变减轻，提示SLC大量表达可能参与结肠炎的病理过程，阻断SLC有可能减轻结肠炎发病。进一步对不同组别大鼠的肠道淋巴细胞培养后发现，SLC对肠道淋巴细胞有趋化作用，结肠炎模型组的淋巴细胞趋化能力明显增强，且移行能力与SLC浓度呈剂量效应关系，但存在饱和现象，SLC抗体可减弱对淋巴细胞的趋化作用。本课题组的前期动物实验[4-5]发现，SLC在结肠炎组织中表达上调，反映了疾病的炎症程度，可作为病情严重程度的评价指标，可能成为潜在治疗的靶点。雷公藤内酯醇能减轻结肠炎小鼠临床症状，并下调SLC表达，表明雷公藤内酯醇对小鼠结肠炎的治疗效应与抑制SLC表达相关，雷公藤内酯醇拮抗SLC的表达可能成为有效的UC治疗方法。

本研究结果发现，SLC在正常人结肠组织中不表达或弱阳性表达，而在UC患者结肠组织中的表达明显上调，且UC病变程度越重，SLC表达阳性率越高，提示其表达与病变程度有一定相关性，这与动物模型研究结果一致，说明SLC在UC局部结肠组织破坏和病理变化中起重要作用，SLC表达增高与UC发病密切相关，提示SLC是UC发病、发展的重要因素。抑制其过表达或靶向性抗体可达到治疗UC的目的，为临床治疗提供新的思路。

总之，SLC参与了UC的发生和发展，反映了疾病的炎症程度，可作为病情严重程度的评价指标，可能成为潜在治疗的靶点。

参考文献

1 陈锡美, 葛步军, 杨长青, 等. 次级淋巴组织趋化因子在实验性大鼠溃疡性结肠炎中的表达及意义[J]. 中华消化杂志, 2006, 26 (9): 614-616.

2 葛步军, 陈锡美, 杨长青, 等. 次级淋巴组织趋化因子在溃疡性结肠炎发病中的作用[J]. 中华胃肠外科杂志, 2008, 11 (6): 561-564.

3 葛步军, 陈锡美, 杨长青, 等. 不同浓度次级淋巴组织趋化因子对溃疡性结肠炎大鼠淋巴细胞迁移的影响及其意义[J]. 中华医学杂志, 2008, 88 (44): 3112-3115.

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6 欧阳钦, 潘国宗, 温忠慧, 等. 对炎症性肠病诊断治疗规范的建议[J]. 中华消化杂志, 2001, 21 (4): 236-239.

7 Thanarajasingam U, Sanz L, Diaz R, et al. Delivery of CCL21 to metastatic disease improves the efficacy of adoptive T-cell therapy[J]. Cancer Res, 2007, 67 (1): 300-308.

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12Kawashima D, Oshitani N, Jinno Y, et al. Augmented expression of secondary lymphoid tissue chemokine and EBI1 ligand chemokine in Crohn’s disease[J]. J Clin Pathol, 2005, 58 (10): 1057-1063.

13Kawashima D, Oshitani N, Jinno Y, et al. Augmented expression of secondary lymphoid tissue chemokine and EBI1 ligand chemokine in Crohn’s disease[J]. J Clin Pathol, 2005, 58 (10): 1057-1063.

(2014-09-12收稿；2014-10-16修回)

·短篇论著·

Expression and Significance of Secondary Lymphoid Tissue Chemokine in Ulcerative ColitisGAODongfeng,ZHOUGuoxiong,CAOWei,CHENHaiqin,ZHANGHaifeng.DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,JiangsuProvince(226001)

Correspondence to: ZHANG Haifeng, Email: zhanghaifeng740702@126.com

Background: Secondary lymphoid tissue chemokine (SLC) is involved in lymphoid homing and anti-tumor immune response, and has a chemotactic effect on intestinal lymphocytes. Several animal studies have shown that SLC is involved in the occurrence and development of ulcerative colitis (UC). Aims: To investigate the expression and significance of SLC in UC. Methods: Forty active UC patients from Dec. 2010 to Dec. 2012 at Affiliated Hospital of Nantong University were enrolled, and 20 healthy volunteers were served as controls. Expression of SLC in the colon mucosa was detected by immunohistochemistry, and its relationship with severity of UC was analyzed. Results: SLC was positively expressed in all UC patients, while was negatively or weakly positively expressed in controls. Expression of SLC in UC patients was significantly higher than that in controls (4.16±0.78vs. 0.52±0.11,P<0.05). Expression of SLC was correlated with the severity of involvement of UC. Conclusions: Expression of SLC participates in development and progress of UC. SLC may play an important role in the induction of local damage and pathological changes of UC.

Key wordsColitis, Ulcerative;Secondary Lymphoid Tissue Chemokine;Immunohistochemistry

通信作者&本文，Email: zhanghaifeng740702@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.05.009