瑞巴派特对阿司匹林所致人结肠癌细胞株Caco-2损伤的保护作用及其机制探讨*

瑞巴派特对阿司匹林所致人结肠癌细胞株Caco-2损伤的保护作用及其机制探讨*

袁芳岑#张振玉&段兆涛姜宗丹

南京医科大学附属南京医院消化科(210006)

*基金项目：南京市医学科技发展项目(YKK13103)

#Email: fangcenyuan@126.com

背景：随着胶囊内镜的问世，非甾体消炎药(NSAIDs)引起的小肠损伤日益受到重视。虽然有多种用于防治NSAIDs相关胃黏膜损伤的药物，但对于NSAIDs相关小肠黏膜损伤，至今仍缺乏有效的防治措施。目的：探讨瑞巴派特对阿司匹林所致人结肠癌细胞株Caco-2损伤的保护作用及其可能机制。方法：以经阿司匹林10 mmol/L处理的Caco-2细胞作为阿司匹林组，经阿司匹林联合不同浓度(0.1、0.5、1.0 mmol/L)瑞巴派特处理的Caco-2细胞作为瑞巴派特组，同时设立阴性对照组。采用MTT实验检测细胞增殖抑制情况；采用流式细胞术检测细胞凋亡情况；采用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；采用Transwell实验检测细胞通透性；采用蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白occludin、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、p38、p-p38、c-Jun氨基端激酶(JNK)、p-JNK表达。结果：瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L 组Caco-2细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、细胞通透性均显著低于阿司匹林组(P<0.05)，且随瑞巴派特浓度升高而逐渐降低(P<0.05)。倒置相差显微镜观察显示，阿司匹林可诱导Caco-2细胞损伤，而瑞巴派特可减轻阿司匹林引起的细胞损伤。与阿司匹林组相比，瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L组occludin、ZO-1、p-JNK表达显著升高(P<0.05)，p-p38、p-ERK1/2表达显著降低(P<0.05)，变化均呈瑞巴派特浓度依赖性(P<0.05)。结论：瑞巴派特可能通过调节MAPK信号通路(抑制p38、ERK1/2磷酸化，促进JNK磷酸化)，使紧密连接蛋白表达上调、细胞通透性降低，从而防治阿司匹林所致Caco-2细胞损伤。

关键词瑞巴派特；阿司匹林；Caco-2细胞；Occludin；闭锁小带蛋白-1；MAP激酶信号系统

阿司匹林是临床上常用于消炎、解热、镇痛以及抗血小板的药物。随着阿司匹林的广泛使用，其对胃十二指肠黏膜的损伤，如引起糜烂、溃疡、出血等已被证实。以往由于缺乏特异、有效的检查手段，阿司匹林相关小肠损伤长期被忽视。随着胶囊内镜的问世，非甾体消炎药(NSAIDs)引起的小肠损伤的检出率显著升高，甚至超过了NSAIDs所致胃损伤的发生率并因此而日益受到重视[1]。近年研究[2]发现，瑞巴派特对NSAIDs引起的小肠损伤具有治疗作用。Caco-2细胞是一种人结肠癌细胞株，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的Caco-2细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层细胞。本研究以阿司匹林和瑞巴派特作用于Caco-2细胞，探讨瑞巴派特对阿司匹林所致Caco-2细胞损伤的保护作用及其可能机制。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人结肠癌细胞株Caco-2由江苏省人民医院普外科惠赠。DMEM高糖培养基购自美国HyClone公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，阿司匹林、DMSO购自Sigma公司，瑞巴派特购自湖北康宝泰精细化工有限公司，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，Transwell小室购自Millipore公司，FITC-Dextran、兔抗人occludin、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)抗体购自Santa Cruz公司，兔抗人细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、p38、p-p38、c-Jun氨基端激酶(JNK)、p-JNK抗体、HRP标记羊抗兔IgG购自Cell Signaling Technology公司。

二、方法

1. Caco-2单层细胞模型建立：Caco-2细胞培养于含20%胎牛血清的DMEM培养基(37 ℃，5% CO2)，隔天更换培养液，每3 d按1∶3 比例传代。

2. MTT实验检测细胞增殖抑制情况：取对数生长期Caco-2细胞，以每孔2×104个接种于96孔板，每孔体积100 μL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，更换无血清培养基饥饿细胞4 h，分别以阿司匹林10 mmol/L(阿司匹林组)以及阿司匹林10 mmol/L+不同浓度瑞巴派特(瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L组)处理细胞，每组设6个复孔，以不含药物的DMEM培养基处理细胞作为阴性对照组。各组继续培养24 h后，每孔加入MTT 50 μL，继续培养4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室温避光充分振荡15 min，以空白孔调零，于酶标仪上检测490 nm波长处吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-实验组A值/阴性对照组A值)×100%。实验重复3次，结果取均值。

3. 流式细胞术检测细胞凋亡情况：取阿司匹林组、瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L组和阴性对照组Caco-2细胞，培养24 h后，以不含EDTA的胰酶消化、离心后收集细胞，PBS洗涤2次，依次加入结合缓冲液 500 μL、Annexin V-FITC和PI各5 μL，混匀后室温避光反应15 min，上流式细胞仪检测。

4. 倒置相差显微镜观察细胞形态学变化：取阿司匹林组、瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L组和阴性对照组Caco-2细胞，于倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。

5. Transwell实验检测细胞通透性：取对数生长期 Caco-2细胞，以每孔1×105个接种于24孔Transwell板(6.5 mm，0.4 μm)，顶端和基底端培养基分别为100 μL和600 μL，每隔1 d更换培养液。嵌入小室的过滤膜为聚碳酸酯膜，细胞在此膜上生长，形成连续的单细胞层。细胞培养至汇满，更换无血清培养基饥饿上层小室内细胞4 h，根据实验分组予相应处理(同步骤2)，同时加入1 mg/mL FITC-Dextran，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养5 min，吸取基底端培养基200 μL 作为基础值，并补足培养基，继续孵育24 h。吸取基底端培养基200 μL，以荧光酶标仪(激发波长490 nm，发射波长520 nm)检测FITC荧光强度，计算通透率[3-4]。Caco-2单层细胞对FITC-Dextran的通透性以通透系数Pa表示。Pa=(样品荧光强度×对照浓度×0.6 mL×103)/[对照荧光强度×通透时间(24 h)×通透膜面积(0.33 cm2)]。检测结果以百分率表示，Pa%=(实验样品Pa值/对照样品Pa值)×100%。

6. 蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白表达：取阿司匹林组、瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L组和阴性对照组Caco-2细胞，加入蛋白裂解液4 ℃裂解，12 000 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。取总蛋白上样，行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，加入 ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、occludin、ZO-1抗体(工作浓度均为 1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗(1∶6 000)，室温孵育2 h，ECL发光，显影，定影，以ImageJ 1.38x软件分析蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达量以其与内参照β-actin条带灰度值的比值表示。

三、统计学分析

结果

一、细胞增殖抑制情况

MTT实验检测结果显示，阿司匹林组、瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L组Caco-2细胞增殖抑制率分 别为(56.23±6.75)%、(44.10±4.78)%、(37.97±2.82)%和(31.00±3.26)%，3组不同浓度瑞巴派特组细胞增殖抑制率均显著低于阿司匹林组(P<0.05)，且随药物浓度升高而逐渐降低(P<0.05)。

二、细胞凋亡情况

A：阴性对照组；B：阿司匹林组；C：瑞巴派特0.1 mmol/L组；D：瑞巴派特0.5 mmol/L组；E：瑞巴派特1.0 mmol/L组

图1流式细胞术检测各组Caco-2细胞凋亡情况

流式细胞术检测结果显示，阴性对照组Caco-2细胞凋亡率为0.7 %(早期凋亡率0.4%，晚期凋亡率0.3%)，阿司匹林组为46.9%(早期凋亡率4.5%，晚期凋亡率42.4%)，瑞巴派特0.1 mmol/L组为35.1%(早期凋亡率8.5%，晚期凋亡率26.6%)，瑞巴派特0.5 mmol/L组为31.2%(早期凋 亡率2.5%，晚期凋亡率28.7%)，瑞巴派特1.0 mmol/L 组为 27.2%(早期凋亡率7.4%，晚期凋亡率19.8%)(图1)。阿司匹林组细胞凋亡率显著高于阴性对照组(P<0.05)，3组不同浓度瑞巴派特组均显著低于阿司匹林组(P<0.05)，且随药物浓度升高而逐渐降低(P<0.05)。

三、细胞形态学变化

倒置相差显微镜观察显示，阴性对照组Caco-2细胞呈不规则类圆形，较均匀贴壁生长；阿司匹林组贴壁细胞数量明显减少，细胞皱缩、悬浮，部分细胞核浓缩；瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L组贴壁细胞数量随药物浓度升高而逐渐增多，细胞形态逐渐接近类圆形，胞核浓缩细胞比率逐渐降低(图2)。

四、细胞通透性

Transwell实验检测结果显示，阿司匹林组Caco-2细胞通透性显著高于阴性对照组(P<0.05)，瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L组细胞通透性均显著低于阿司匹林组(P<0.05)，且随药物浓度升高而逐渐降低(P<0.05)(图3)。

五、紧密连接蛋白和MAPK信号通路相关蛋白表达

蛋白质印迹法检测结果显示，与阴性对照组相比，阿司匹林组Caco-2细胞occludin、ZO-1、p-JNK表达显著降低(P<0.05)，p-p38、 p-ERK1/2表达显

著升高(P<0.05)；与阿司匹林组相比，瑞巴派特0.1、0.5、1.0 mmol/L组occludin、ZO-1、p-JNK表达显著升高(P<0.05)，p-p38、p-ERK1/2表达显著降低(P<0.05)，变化均呈瑞巴派特浓度依赖性(P<0.05)(图4、图5)。

*与阴性对照组比较，P<0.05；#与阿司匹林组比较，P<0.05

0：阴性对照组；1：阿司匹林组；2：瑞巴派特0.1 mmol/L组；3：瑞 巴派特0.5 mmol/L组；4：瑞巴派特1.0 mmol/L组

图3Transwell实验检测各组Caco-2细胞通透性

A：阴性对照组；B：阿司匹林组；C：瑞巴派特0.1 mmol/L组；D：瑞巴派特0.5 mmol/L组；E：瑞巴派特1.0 mmol/L组

*与阴性对照组比较，P<0.05；#与阿司匹林组比较，P<0.05

1：阴性对照组；2：阿司匹林组；3：瑞巴派特0.1 mmol/L组；4：瑞巴派特0.5 mmol/L组；5：瑞巴派特1.0 mmol/L组

图5各组Caco-2细胞紧密连接蛋白和MAPK信号通路相关蛋白表达蛋白质印迹法电泳图

讨论

目前虽然有多种用于防治NSAIDs相关胃黏膜损伤的药物，但对于NSAIDs相关小肠黏膜损伤，至今仍缺乏有效的防治措施。研究[5]指出，质子泵抑制剂(PPIs)奥美拉唑对NSAIDs引起的小肠损伤无防治作用，兰索拉唑效果亦很有限。另有研究[6]发现，NSAIDs与PPIs联合应用对小肠的损伤较单用NSAIDs更为严重。2013年西班牙专家关于NSAIDs肠病防治的共识意见指出，瑞巴派特具有抗炎以及刺激胃黏膜分泌前列腺素的作用，对NSAIDs引起的小肠损伤具有显著防治效果[7]。新近Kurokawa等[8]进行的一项多中心临床研究亦发现，瑞巴派特对阿司匹林引起的小肠损伤具有治疗作用。然而，NSAIDs肠病发生的具体机制迄今尚未明确。

阿司匹林引起的肠损伤以小肠为主。本研究选用Caco-2细胞作为人小肠细胞模型， 其可形成与小肠细胞相同的细胞极性和致密的单细胞层组织，形态亦类似人小肠上皮细胞，且可分泌与人类相同的酶类以及转化因子，临床上常用于建立体外肠黏膜屏障模型。本研究MTT实验检测结果显示，阿司匹林组Caco-2细胞增殖抑制率达50%以上，而不同浓度瑞巴派特组与阿司匹林组相比，细胞增殖抑制率随药物浓度升高而逐渐降低，证实阿司匹林可抑制Caco-2细胞增殖，而瑞巴派特可减弱此抑制作用，作用呈浓度依赖性。以流式细胞术检测细胞凋亡，结果与MTT实验结果一致，证实瑞巴派特可浓度依赖性地抑制阿司匹林引起的Caco-2细胞凋亡。以倒置相差显微镜观察细胞形态学变化，阿司匹林组Caco-2细胞皱缩、悬浮，部分细胞核浓缩，而在瑞巴派特组，随着药物浓度的升高，贴壁细胞数量逐渐增多，细胞形态逐渐接近类圆形，胞核浓缩细胞比率逐渐降低，证实瑞巴派特可减轻阿司匹林引起的Caco-2细胞损伤。

Transwell实验主要用于研究肿瘤侵袭能力，亦可检测单层细胞通透性[3-4]。本研究发现，阿司匹林组Caco-2细胞通透性最高，与阿司匹林组相比，不同浓度瑞巴派特组细胞通透性随药物浓度升高而逐渐降低，作用呈浓度依赖性。细胞通透性与细胞间紧密连接密切相关，occludin和ZO-1是紧密连接的重要组成成分[9-10]。本研究蛋白质印迹法检测结果显示，与阿司匹林组相比，不同浓度瑞巴派特组Caco-2细胞occludin、ZO-1相对表达量随药物浓度升高而逐渐增高，提示瑞巴派特对Caco-2细胞的保护作用与增强细胞间紧密连接以降低细胞通透性有关。

研究显示细胞间紧密连接受MAPK信号通路调节[11-14]。MAPK有3个主要亚族，分别为ERK1/2、JNK和p38MAPK，其中ERK1/2信号转导通路参与调控细胞生长和分化，JNK和p38MAPK信号转导通路在炎症、细胞凋亡等病理反应中发挥重要作用。Masamune等[15]的研究证实，瑞巴派特能调控MAPK激酶磷酸化水平。本研究蛋白质印迹法检测发现，阿司匹林组Caco-2细胞与阴性对照组相比，p-p38、p-ERK1/2相对表达量显著升高，p-JNK相对表达量显著降低，而不同浓度瑞巴派特组与阿司匹林组相比，p-p38、p-ERK1/2相对表达量显著降低，p-JNK相对表达量显著升高，表达变化均呈瑞巴派特浓度依赖性。根据上述实验结果，推测瑞巴派特系通过抑制MAPK信号通路中的p38、ERK1/2磷酸化水平，提高JNK磷酸化水平，从而上调下游紧密连接蛋白occludin、ZO-1表达，使Caco-2细胞通透性降低，以维持小肠黏膜的完整性。

本研究组前期研究[16]发现，阿司匹林诱导胃上皮细胞损伤的作用可能是通过抑制ERK信号转导通路实现的，而本研究却显示阿司匹林可能通过激活ERK信号转导通路而诱导肠黏膜上皮损伤，可见同种NSAIDs作用于不同靶器官所引起的MAPK信号通路改变不尽相同。且本研究仅检测了MAPK信号通路的改变，未进一步明确其改变是受上游信号调控抑或是其他信号通路改变的代偿反应，有待进一步研究。

综上所述，瑞巴派特可能通过调节MAPK信号通路(抑制p38、ERK1/2磷酸化，促进JNK磷酸化)，使紧密连接蛋白occludin、ZO-1表达上调、细胞通透性降低，从而防治阿司匹林所致Caco-2细胞损伤，达到保护肠黏膜的作用。

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(2014-12-19收稿；2015-01-16修回)

Protective Effect and Mechanism of Rebamipide on Injury of Human Colon Cancer Cell Line Caco-2 Induced by AspirinYUANFangcen,ZHANGZhenyu,DUANZhaotao,JIANGZongdan.DepartmentofGastroenterology,NanjingHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing(210006)

Correspondence to: ZHANG Zhenyu, Email： zhangzhenyu808@126.com

Background: With the development of capsule endoscopy, small intestinal injury induced by non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) has become an issue of growing concern. Although there are a variety of drugs used for NSAIDs-induced gastric mucosal injury, small intestinal injury caused by NSAIDs is lack of effective prevention and treatment modalities. Aims: To investigate the protective effect and possible mechanism of rebamipide on human colon cancer cell line Caco-2 injury induced by aspirin. Methods: In aspirin group, Caco-2 cells were treated with aspirin 10 mmol/L; in rebamipide group, Caco-2 cells were treated with aspirin and different concentrations of rebamipide (0.1, 0.5, 1.0 mmol/L), and a negative control group was established. Cell proliferation inhibition was measured by MTT assay. Cell apoptosis was determined by flow cytometry. Morphological changes of cells were observed under inverted phase contrast microscope. Permeability of cells was assessed by Transwell assay. Expressions of tight junction proteins occludin and zonula occluden-1 (ZO-1), as well as mitogen activated protein kinase (MAPK) signaling pathway-associated proteins including extracellular signal-regulated kinase (ERK)1/2, phosphorylated ERK1/2 (p-ERK1/2), p38, p-p38, c-Jun N-terminal kinase (JNK), and p-JNK, were determined by Western blotting. Results: Proliferation inhibition rate, apoptosis rate and permeability of Caco-2 cells in rebamipide 0.1, 0.5, 1.0 mmol/L groups were significantly lower than those in aspirin group in a dose-dependent manner (P<0.05). Injuries of Caco-2 cells were seen in aspirin group by inverted phase contrast microscope and rebamipide could reduce these injuries. Expressions of occludin, ZO-1 and p-JNK were significantly higher and expressions of p-p38 and p-ERK1/2 were significantly lower in rebamipide 0.1, 0.5, 1.0 mmol/L groups than those in aspirin group in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusions: Rebamipide have a protective effect against aspirin-induced Caco-2 cell injury, probably through regulating MAPK signaling pathway (inhibiting p38 and ERK1/2 phosphorylation, stimulating JNK phosphorylation), and subsequently up-regulating the expressions of tight junction proteins and decreasing the permeability of cells.

Key wordsRebamipide;Aspirin;Caco-2 Cells;Occludin;Zonula Occluden-1;MAP Kinase Signaling System

通信作者&本文，Email: zhangzhenyu808@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.05.004