常用类风湿关节炎动物模型研究概况及展望

李艳玲，祁 芳，许 明，艾 坤，杨茜芸*，刘 梨，张 泓

（1湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

常用类风湿关节炎动物模型研究概况及展望

李艳玲1，祁 芳1，许 明1，艾 坤1，杨茜芸1*，刘 梨2，张 泓1

（1湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

在类风湿关节炎（RA）的基础研究领域，构建和应用合适的动物模型是研究该疾病发病机制及治疗的基础，构建复制接近人RA疾病特征的动物模型尤为重要。近年来建立了不少RA动物模型，主要有单纯疾病动物模型和病证结合动物模型，但均存在各自的优势和劣势，本文对近几年常用的几种RA动物模型进行研究，从制备方法、模型特点、发病机制、使用情况等方面对比其优缺点，以期为今后研究更接近人RA疾病特征的动物实验模型提供参考。

类风湿关节炎；动物模型；优劣势

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因病机尚未完全清楚的慢性、炎性、多系统性自身免疫性疾病。其临床特点为对称性，多个关节慢性炎性持续反复发作，主要病理变化包括滑膜组织增生、血管翳形成及韧带、骨和软骨的结构性损伤，最终引起整个关节僵硬导致功能丧失[1]。RA是常见的高致残率疑难杂病之一，我国RA的患病率为0.32%～0.36%，女性患者约3倍于男性[2]。RA是全世界研究的热点之一，作为科学的科研实验设计，建立有效的动物模型是其关键[3]，许多专家学者在RA动物实验研究的过程中已建立多种动物模型，但都有各自的优缺点。本文现从近5年常用的几种RA动物模型的造模方法、特点、发病机制、使用情况等方面进行研究，对比其优缺点，以期为今后探索更接近人RA疾病特征的动物模型提供参考。

1 单纯疾病动物模型

1.1 胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis， CIA)动物模型

CIA模型是Trentham等1977年最先创建的实验性关节炎模型，并且发现约50%的RA患者血液中存在抗Ⅱ型胶原的自身抗体，提示Ⅱ型胶原可能诱导RA的产生，此后国内外众多学者采用该模型针对RA的病因机制、药物筛选及治疗等方面进行了大量研究。目前已建立大鼠、小鼠CIA模型。

1.1.1 大鼠CIA模型 制备方法：将Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L的冰醋酸中，制成2 g/L浓度，然后与完全弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂二者等体积混合制成乳化剂，使终质量浓度为1 g/L。将乳化后的液体滴在水中后不扩散且成形，视为乳化完全。于大鼠背部与尾根部多点皮内注射胶原乳化剂皮内注射0.2 mL（含200μgⅡ型胶原）乳剂，7 d后加强免疫相等剂量乳剂1次，建立CIA模型[4-5]。

模型特点：初次致敏后，因炎症作用，尾根注射部形成小溃疡灶，可在1周内自行结痂愈合。随后大鼠前后足可出现不同程度的红斑，再次加强免疫后关节红肿进一步加重，21 d左右足爪肿胀达高峰，后期大鼠表现为难以负重、活动受限，部分大鼠出现足趾变形，并随着关节炎的发生发病大鼠毛色开始失去光泽，伴轻微脱毛，体质量增长缓慢，活动减少[6-8]。

发病机制：CIA的产生和发展依赖于自身T细胞和B细胞的激活，去除B细胞或T细胞，动物都不能用Ⅱ型胶原免疫诱发关节炎病变[9]。研究表明，在CⅡ（CIA小鼠胶原）免疫的动物中，T细胞可被自身和异种CⅡ特异性免疫反应激活，从而介导迟发性超敏反应，继而激活B细胞，分泌炎性细胞因子。胶原抗体可形成的免疫复合物与补体相互作用，启动炎症反应。CD4+T细胞是CIA的主要调节因素，分泌细胞因子白介素17（IL-17），产生中性粒细胞及其他促炎因子，与CIA产生关系密切[10]。另外有研究表明，促炎介质肿瘤坏死因子（TNF-α）、IL-1β在诱导CIA大鼠中起重要作用，并随着CIA大鼠病程进展血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平持续升高[11-12]。

1.1.2 小鼠CIA模型 制备方法：将CⅡ 4 mg/mL溶于0.05 mol/L冰醋酸中，与完全弗氏佐剂CFA等体积完全混合乳化，使终质量浓度为1 g/L，小鼠尾根部皮内注射50μL混合溶液，首次免疫后3周行第2次免疫，方法同第1次(佐剂换为弗氏不完全佐剂)，于小鼠尾根部皮下注射50μL混合溶液，进行加强免疫[13-14]。

模型特点：开始出现关节肿胀是在致敏后第29～32天，两后足最先受累，进而逐渐累及前足和尾部，第36～45天足肿胀达最高峰，然后逐渐减轻。小鼠毛色、精神状态、粪便和体质量等在21 d前无显著变化，21 d后小鼠毛色开始失去光泽，轻微脱毛，体质量增长减慢甚至减轻，部分小鼠足趾关节、尾部出现化脓溃烂，但鼻、耳肿胀不明显[15-17]。

发病机制：CIA小鼠病理进程中，B淋巴细胞和作为软骨组成成分的Ⅱ型胶原是CIA发生的关键，说明CIA是免疫性炎症。T淋巴细胞促进胶原特异性B淋巴细胞活化，诱导免疫的发生[18-19]，特异性胶原抗体与胶原蛋白结合，在关节部位形成复合物，激活补体。另外粒细胞、T淋巴细胞和单核细胞募集到关节部位，导致免疫反应进一步激发，产生大量细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-32介导免疫介质，破坏骨和软骨[20-22]。

1.2 佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）动物模型

AA模型又称弗氏佐剂关节炎，是由细菌学家Freund创立，是RA动物模型创建的基本方法。

造模方法：将热灭活的结核分枝杆菌与矿物油研磨混匀，根据实验需要配制成所需浓度，一次性经尾根部皮下注射或足跖皮下注射CFA 0.1 mL致炎如果肿胀不明显，可考虑加强免疫1次[23-24］。

模型特点：于致炎后9～12 d左右开始出现足趾关节出现不同程度的红肿，21 d左右达到高峰，表现为前后足肿胀，且进行性加重，行动不便，足趾皮肤发红发亮，炎症高峰期持续3～5 d，随后有自愈倾向，发病过程中部分大鼠趾关节有化脓溃烂情况，耳和尾部出现“关节炎”小结，体温身高，进食减少，体质量下降[25-26]。

发病机制：AA的发病原理主要是分子模拟理论。BCG来源的结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65），与关节滑膜上自身抗原HSP60结构相似，有高度相似的保守序列，同一株T细胞克隆可识别两者。从而在结核分枝杆菌不断刺激下，引起机体自身的免疫反应[27-28]。

1.3 CIA与AA动物模型的使用情况

通过对CNKI数据库的查询，近五年使用CIA造模约521篇，逐年有增长趋势，但幅度不大；而AA近五年有534篇，每年使用情况相差不大。见表1。

表1 近5年CIA与AA动物模型使用文献统计（篇）

同时，还有许多其他单纯型RA动物模型，如软骨低聚体基质蛋白、卵蛋白、佐剂角叉菜胶诱导的关节炎等。但是这些模型一般用于特定的研究，因此每年使用情况不多，与CIA、AA比较差距很大。可以看出CIA与AA目前仍然是最重要且发展较成熟的两种RA动物模型复制方法。

1.4 CIA与AA的优缺点

1.4.1 CIA的优缺点 CIA的关节炎发病率比AA高，且CIA模型临床症状、病理学更接近人RA[29]。不仅具有R A的急性病变外，还有一定的慢性病变特征，且操作方便简单，是目前国际上公认的RA相关研究的最佳动物模型[30]。然而它也有自身限制，不能描述病情的加重与缓解。目前大小鼠CIA模型制作没有一个规范统一的标准，如免疫剂量、免疫部位，是否加强免疫，何时加强免疫等都没有统一规定，大多都是根据实验的需要选择。另外，国外进口CⅡ价格昂贵，而国内尚无批量生产。这些都说明CIA模型的局限性。

1.4.2 AA的优缺点 此方法建立较早，简单易行、耗费少，其病理表现也类似于人RA，是目前最经典应用最广泛的RA模型复制方法。但该模型发病快、病程单一，缺乏慢性病理过程且在免疫学特征及病理生理学方面与人类RA存在一定的差异，病变具有一定自限性。另外，AA存在发病程度不均匀、模型复制率偏低等问题，影响实验的进程。

2 病证结合动物模型

在中医药研究领域，近年来，根据RA临床特征，许多学者在CIA、AA基础上，结合西医的病和中医的证，创建了病证结合的RA模型。目前，常见的有风寒湿痹症模型、风湿热痹症模型和肾虚痹症模型。

2.1 AA、CIA模型基础上的风寒湿刺激模型

姜辉等[31]在SD大鼠右后足趾皮内注射CFA 0.1 mL，并在造模当天，将大鼠置于深为2 cm，温度为5～7℃的冷水中，同时伴以4级风力，每天1次，每次20 min，连续14 d。镇兰芳等[32]从大鼠首次注射CⅡ开始，每天在人工气候箱内[温度：（6±2）℃，相对湿度：（90±4）%，风力3级]，接受风寒湿刺激1次，每次持续刺激4 h，连续30 d。

模型特点：本模型的制备，是在CIA、AA制备的基础上，通过中医风寒湿的外因刺激而建立。体现了中医风寒湿痹证的发病病因及病理特点。但是目前在外界气候环境、刺激时间及频率等条件上尚无统一规范的标准。

发病机制：风、寒、湿可加重局部炎症浸润的程度，它们能严重影响ESR、IL-17、CD44、AHR、Fas、FasL等的表达，并能加重滑膜细胞的增生。提示中医痹证病因学说包含气候条件和感染因素等。

2.2 AA、CIA模型基础上的风湿热刺激模型

高慧琴等[33]以Wistar大鼠为对象建立AA模型，并将大鼠置于深为2 cm，温度36～38℃热水中，同时在37℃水浴恒温热蒸汽条件下熏蒸，伴以3档风力，每天1次，每次20 min，连续14 d。上述镇兰芳等[32]在接受首次CIA免疫的当天开始，每天在人工气候箱内 [相对湿度：（90±4）%，温度：（33± 2）℃，风力3级]接受风湿热刺激1次，且持续刺激4 h，连续30 d。

模型特点：本模型在AA或CIA的基础上，采用中医风湿热的外因刺激诱导模型，比单纯AA或CIA模型有炎症周期长、模型稳定的特点，但单纯的风湿热外界刺激因素结合CIA、AA建立的模型，不能完全体现临床风湿热痹症多为风寒湿证日久转化而来的特点。

发病机制：持续高温一方面可使血管扩张、血管渗透性增大，导致胶体渗出增多；另一方面引起机体应激反应，致使免疫系统的变化。另外有研究表明，风热湿等外邪能加重CD44的表达，提示CD44可能参与了CIA的发生[32]。

2.3 肾虚痹证模型

根据临床中医认为肾虚为RA发生的根本原因；同时结合现代医学认为男性雄激素下降而雌激素升高，女性雌激素减少或者卵巢功能低下皆为肾虚的表现建立肾虚CIA模型。方法1[34-35]：摘除大鼠双侧卵巢或睾丸及其附近的脂肪组织，28 d后于尾根部皮下注射200μg经不完全弗氏佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原，此后第7天再次尾根部同法注射100μg CⅡ作为加强免疫；方法2：予羟基脲375 mg/(kg·d)连续灌胃17 d后，依上述方法建立CIA模型，最终复制成肾虚CIA模型。

模型特点：此模型是在中医痹证发病的内因学说基础上建立，与单纯的CIA模型相比，关节肿胀程度高，滑膜组织炎症加重，软骨损伤及骨的破坏均更为严重。此模型血清雌二醇水平下调，而血清Ca和TNF-α的含量则显著增加。

发病机制：肾虚使类风湿性关节炎发病率提高，不同的肾虚模型主要通过免疫系统 (包括体液和细胞免疫)、内分泌系统(如性腺激素、肾上腺素)、骨代谢(如血清Ca等)来共同影响RA的病理变化。2.4 病证结合动物模型的使用情况

通过对CNKI数据库的查询，在中医药研究领域，近五年风湿热、风寒湿、肾虚痹症动物模型使用情况逐年增加，另外，还有一些其他病症结合RA动物模型，如脾虚痹证模型、气虚血瘀模型等，但是这些模型一般根据实验研究需要采用，因此每年使用情况不多。在中医药科研工作中，病症结合模型是关键，是广大科研工作者值得深思和探索的问题之一。

3 问题与展望

单纯疾病RA动物模型，特别是AA与CIA模型建立比较早，发展比较成熟，在临床表现、实验室指标和病理机制上，可通过具体数据、检测指标、切片等体现，且在临床表现、病理、免疫上与人RA在有着相似或相近的特点，客观性较强，是最常用的经典模型，也是RA实验研究的重要手段，但依然不能完全反应所有人RA的所有临床特点，且其模型制备方法和条件缺乏相对统一规范的标准，存在一些缺陷。另外，在中医药研究领域，这种模型复制方法无明显的临床病因学基础，完全偏离了传统的临床辨证方式，未能反映出中医辨证论治的特色。所以，探索一种经济方便、科学全面，与人RA特点更接近的动物模型仍是今后自身免疫性关节炎模型研究的方向所在。

病证结合动物模型，是在单纯疾病动物模型过程中融入中医病因因素，建立所需的模型，运用了中医病因学说，也符合现代医学RA病理特点，体现了中医辨证论治的特色，但此类模型存在的问题是，西医的“病”与中医“病”是两个截然不同的概念。另外，人为施加的干预因素可能改变原有的动物模型，此类模型的稳定性、可靠性值得质疑。目前病因造模缺乏明确的判定标准，都是在多种干预因素之间没有逻辑关系的情况下，强行叠加到一起，即“病+证”的“1+1”的模式，不满足辨证论治是中医对疾病的诊断和分类的这一基本原则，偏离了客观性、科学性。为了获得更好的能模拟临床RA病人的病证结合动物模型，需要充分考虑中医病因学说，注重中医临床症状学和辨证论治，还需动态评价证候属性，来探寻一种具有中医临床辨证特点的RA病证结合实验动物模型。

[1]马武开，姚血明，唐 芳，等.类风湿关节炎患者生存质量调查分析[J].中华中医药杂志，2011，26（1）：2 734-2 736.

[2]McInnes IB，O’Dell JR.State-of-the-art：rheumatoid arthritis[J]. Ann Rheum Dis，2010，69（11）：1 898-1 906.

[3]Haleagrahara N，Swaminathan M，Chakravarthi S.Therapeutic Efficacy of Vitamin E δ-Tocotrienol in Collagen-Induced Rat Model of Arthritis[M].Biomed Res Int，2014.

[4]Sharma S，Gupta R，Thakur SC.Attenuation of collagen induced arthritis by centella asiatica methanol fraction via modulation of cytokines and oxidative stress[J].Biomed Environ Sci，2014，27 (12)：926-938.

[5]杨 渐，蔡宏达，曾玉兰，等.大鼠胶原诱导关节炎模型的建立及评价[J].海峡药学，2014(9)：27-31.

[6]杨 波，梁清华，吴 丹，等.胶原诱导性关节炎大鼠滑膜血管内皮生长因子与微血管密度[J].中国组织工程研究，2014(7)：1 051-1 056.

[7]许金鑫，张 育，张学增，等.金雀异黄素抗Ⅱ型胶原诱导型关节炎大鼠滑膜血管新生的研究[J].中西医结合学报，2011，9(2)：186-193．

[8]刘 静，邸志权，王晶晶.胶原诱导性关节炎大鼠淋巴细胞基因表达的变化[J].药物生物技术，2013，20(2)：115-123.

[9]石 磊，李小峰，王彩虹，等.大鼠胶原诱导性关节炎模型的制备及评价[J].临床医药实践，2011，20(4)：245-247.

[10]Lamacchia C，Palmer G，Seemayer CA，et al.Enhanced Th1 and Th17 responses and arthritis severity in mice with a deficiency of myeloid cell-specific interleukin-1 receptor antagonist[J].Arthritis Rheum，2010（62）：452-462.

[11]Karatas A，Koca SS，Ozgen M.Pemetrexed Ameliorates Experimental Arthritis in Rats[M].Inflammation，2014.

[12]王 钢，王丽琴，王 佳，等.秦艽醇提物对胶原诱导性关节炎大鼠血清抗-CCP及TNF-α的影响 [J].中国实验方剂学杂志，2013，19(19)：302-305.

[13]杨 燕，杨懿铭，李振华，等.雷帕霉素联合人脐带血CD4+ CD25+调节性T细胞治疗胶原诱导性关节炎小鼠的初步研究[J].中国免疫学杂志，2014，30(1)：67-72.

[14]Yoshimura S，Asano K，Nakane A.Attenuation of collagen-induced arthritis in mice by salmon proteoglycan[M].Biomed Res Int，2014.

[15]陈秋华，唐 培，谢 彤，等.嗜碱性粒细胞在胶原诱导性关节炎模型小鼠Th1／Th2应答失衡中的作用 [J].中国比较医学杂志，2014，24(6)：7-11.

[16]刘瑞敏，王明丽，朱诗白，等.DBA／1小鼠胶原诱发关节炎模型的特征[J].河南大学学报（医学版），2013，32(4)：266-269.

[17]胡银秀，陆亚华.CCL20单克隆抗体与雷公藤治疗胶原诱导性关节炎模型小鼠的对照研究[J].临床荟萃，2012，27(10)：861-864，封2.

[18]Frank Petersen and Xinhua Yu．A novel preclinical model for rheumatoid arthritis research [J].Arthritis Res Therapy，2010，12(6)：148．

[19]Liu YJ，Zhang LL，Wu YQ，et al．Therapeutic effects of TACIIg on collagen-induced arthritis by regulating T and B lymphocytes function in DBA/1 mice[J]．European J Pharmacol，2011，654(1)：304-314．

[20]Ferraccioli G，Bracci-Laudiero L，Alivernini S.Interleukin-1β and interleukin-6 in arthritis animal models：roles in the early phase of transition from acute to chronic inflammation and relevance for human rheumatoid arthritis，2010，16(11-12)：552-557.

[21]肖智勇，张令令，张小锐，等.小鼠胶原诱导性关节炎模型的建立及其免疫学变化研究[J].中国比较医学杂志，2011，21(10)：136-140.

[22]夏 勇，林丽英，王 征，等.IL-32在小鼠类风湿关节炎发病中的表达及其意义[J].实用医学杂志，2014，30(13)：2 058-2 060.

[23]车 萍，季旭明，梁 粟，等.独活寄生汤对佐剂性关节炎大鼠的抗炎镇痛作用及血清中5-HTP，5-HIAA的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(19)：170-173.

[24]Wang D，Chang Y，Wu Y，et al.Therapeutic effects of TACIIg on rat with adjuvant arthritis[J].Clinical and Experimental Immunology，2010，163(2)：225-234.

[25]佟 丽，辛增辉，陈育尧，等.Mtb诱导的SD大鼠佐剂性关节炎模型的建立及评价[J].中国药理学通报，2009，25(2)：259-263.

[26]李培培，解国雄，宋珊珊，等.大鼠佐剂性关节炎模型表现特征及评价指标[J].中国免疫学杂志，2012，28(5)：453.

[27]Zhang W，Zhang J，Zhang M.Protective effect of Asarum extract in rats with adjuvant arthritis[J].Exp Ther Med.2014，8 (5)：1 638-1 642.

[28]Bevaart L，Vervoordeldonk MJ，Tak PP，et al．Evaluation of therapeutic targets in animal models of arthritis：how does it relate to rheumatoid arthritis?[J].Arthritis Rheum，2010，62(8)：2 192-2 205．

[29]李 沙，傅颖媛，尧荣凤，等.胶原诱导的关节炎和佐剂诱导的关节炎大鼠模型的制备[J].江西医学院学报，2009，49(12)：17-19，26，封2，封3.

[30]Zhao W，Tong T，Wang L，et al．Chicken typeⅡ collagen induced immune tolerance of mesenteric lymph node lymphocytes by enhancing beta2-adrenergic receptor desensitization in rats with collagen-induced arthritis[J]．International Immunopharmacol，2011，11(1)：12-8．

[31]姜 辉，刘 健，高家荣，等.五味温通除痹胶囊对类风湿关节炎风寒湿痹阻证模型大鼠的治疗作用[J].风湿病与关节炎，2012，1 (6)：23-27.

[32]镇兰芳，宋 玉，张六通.外感风寒湿热对胶原诱导关节炎CD44水平的影响[J].辽宁中医药大学学报，2013，15(10)：159-161.

[33]高慧琴，吴国泰，孙少伯，等.秦艽不同配伍对风湿痹证模型大鼠血清炎症因子水平的影响[J].中医杂志，2013，54(9)：785-788.

[34]王 燕，赵宏艳，刘梅洁，等.类风湿关节炎肾虚证大鼠模型的建立[J].中西医结合学报，2011，9(9)：973-982.

[35]肖 诚，赵宏艳，王 燕，等.益肾蠲痹丸对肾虚证与脾虚证胶原诱导性关节炎大鼠的疗效比较[J].中日友好医院学报，2014，28 (2)：102-107.

（本文编辑 匡静之）

General Situation and Prospect of the Commonly Used Rheumatoid Arthritis Animal M odels

LI Yanling1,QI Fang1,XU Ming1,AI Kun1,YANG Qianyun1*,LIU Li2,ZHANG Hong1
（1.College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

In the field of rheumatoid arthritis(RA)research，establishing and applying appropriate animal models are the study foundation of the pathogenesis and treatment for this disease.Moreover,constructing an RA animal model that similar to the human disease characteristics is particularly important.In recent years,numerous RA animal models including single disease models and integrated disease and syndrome models were built,all of them show advantages and disadvantages. This paper reviews these RA animal models on its advantages and disadvantages with the preparation methods,model features, pathogenesis and applying,and provides a reference for future exploration of RA animal model with more similar to human disease characteristics.

rheumatoid arthritis;animal models;advantages and disadvantages

R684.3；R24

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.020

2014－11－14

国家自然科学青年基金(81303048)；湖南省科技厅科技计划一般项目(2014SK3046)；湖南省教育厅科学研究项目(14C0854)。

李艳玲，女，在读硕士研究生，研究方向：经脉与脏腑相关规律及机制研究。

*杨茜芸，女，副教授，硕士研究生导师，E-mail：5787162@qq.com。