不同诱变方法选育嗜酸乳杆菌NX26类细菌素高产菌株

高钰淇,党丽娟,别小妹,吕凤霞,赵海珍,陆兆新

(南京农业大学食品科学技术学院,江苏南京 210095)



高钰淇,党丽娟,别小妹,吕凤霞,赵海珍,陆兆新*

(南京农业大学食品科学技术学院,江苏南京 210095)

采用60Co γ射线、硫酸二乙酯(DES)、原生质体紫外3种诱变方法对嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NX2-6进行诱变,以期获取高产类细菌素菌株。结果表明,60Co γ射线诱变的最佳辐照剂量为2.0kGy,DES处理的最佳条件是浓度为0.7%的DES处理菌体10min,原生质体紫外诱变最佳照射时间为20s,分别得到高产菌γ56,D47和UV156,它们的抑菌效价分别为6096.78,5384.98U/mL和6230.79U/mL,是出发菌株抑菌效价(2819.36U/mL)的2.16、1.91、2.21倍。传代表明,突变株γ56、D47、UV156具有稳定的遗传性。

60Coγ射线诱变,DES诱变,原生质体紫外诱变,稳定性

细菌素是由核糖体合成的具有抗菌活性的多肽或蛋白质,但它的抗菌谱通常较窄[1-2],仅抑制革兰氏阳性菌,对革兰氏阴性菌和真菌没有抑菌活性,而且只有乳酸链球菌肽(Nisin)是被美国食品和药物管理局认证的GRAS(generally recognized as safe)级别的细菌素[3],迄今为止,Nisin已在全世界很多国家和地区被用作食品防腐剂。类细菌素是指不符合或不完全符合细菌素定义的拮抗物质[4],类细菌素具有广谱抗菌特性,不仅能抑制革兰氏阳性菌,而且对革兰氏阴性菌和真菌也有抑制作用。

本实验室保藏了一株产类细菌素的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NX2-6[5],但其产量不是很高。通过遗传改良选育高产菌株,是提高其类细菌素产量的关键。解西玉[6]等用60Coγ射线对曲酸生产菌进行诱变选育高产菌,产量提高292.2%。常峰等[7]对类细菌素高产菌布式乳杆菌CF10经紫外线照射(UV)和硫酸二乙酯(DES)多轮复合诱变,CF10发酵液相对效价较未诱变前提高了258%且具有良好的传代稳定性。汤斌等[8]以米曲霉3.042为出发菌株,对其原生质体进行紫外诱变,筛选得到蛋白酶活力提高1.8倍的高产菌株。本实验通过60Co γ射线诱变、DES诱变、原生质体紫外诱变筛选出3株类细菌素高产且稳定遗传的菌株,为后续类细菌素的进一步研究打好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

出发菌株:嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NX2-6,由南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保藏；指示菌:藤黄微球菌(CMCC 28001)；脱脂乳培养基:脱脂乳10.0g,酵母浸出粉(OXOID)0.1g,蒸馏水90mL,121℃,灭菌7min；NA:牛肉浸膏3.0g,鱼粉蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,琼脂1.8～2.0g,水1000mL,121℃,灭菌20min；MRS液体培养基:蛋白胨(SCRC)10.0g,牛肉浸 8.0g,酵母浸出粉(OXOID)4.0g,葡萄糖20.0g,吐温-80 1.0g,KH2PO4·3H2O 2.0g,乙酸钠5.0g,MgSO4·7H2O 200.0mg,MnSO4·H2O 40.0mg,柠檬酸氢二铵2.0g,蒸馏水1000mL,pH 5.7,121℃,灭菌15min；MRS固体培养基:MRS液体培养基中加入琼脂18～20g/L；2%(v/v)硫酸二乙酯(DES):2mL硫酸二乙酯(DES)原液加入9.8mL无水乙醇；高盐缓冲液:含0.6mol/L NaCl的0.05mol/L pH7.0的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液；再生培养基:MRS固体培养基中加入2%葡萄糖,0.2mol/L蔗糖,15mmol/L MgCl2,pH6.5；溶菌酶液:用高盐缓冲液配制溶菌酶液,浓度为100mg/mL。

超净台(SW-CJ-IBU) 苏净集团安泰公司；pH计(Orion 3-Star) 美国Thermo公司；飞鸽牌系列离心机 上海安亭科学仪器厂；高压蒸气灭菌锅 日本TOMY公司；恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂；隔水式电热恒温培养箱(PYX-DHS-50X65) 上海跃进医疗器械厂；电子天平(AY120) 日本岛津公司；游标卡尺 上海恒量量具有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Nisin标准效价曲线的测定 准确称取0.16g Nisin标准品(106U/g,美国Sigma公司产品)溶于10mL的0.02mol/L的稀盐酸中,配成浓度为16000U/mL的Nisin标准液备用,再用0.02mol/L的稀盐酸分别稀释至8000、4000、2000、1000、500、250U/mL,采用管碟法测定Nisin标准品对浓度为106CFU/mL的藤黄微球菌抑菌圈直径,绘制Nisin效价的对数值和抑菌圈直径之间关系的标准曲线[9]。从而根据实验菌株类细菌素抽提液对藤黄微球菌的抑菌圈直径换算出类细菌素的效价。实验所得的嗜酸乳杆菌NX2-6类细菌素的效价等同于对藤黄微球菌具有相同抑菌效果的Nisin标准品的效价[7,10]。

1.2.2 菌悬液的制备 将出发菌以2%接种量移入50mL脱脂乳培养基中37℃培养12h待凝乳,再以2%接种量移入50mL液体MRS培养基中37℃培养10～12h,传代2次后培养至对数末期。

1.2.360Co γ射线诱变 取14支灭菌的离心管,每管分别装入新制备的菌悬浮液1mL。辐射剂量分别为0.2、0.4、0.5、1、1.5、2.0、3.0kGy。将每管进行稀释,取0.1mL涂平板,37℃培养,计平板菌落数,分别计算致死率和正突变率。

1.2.4 硫酸二乙酯(DES)诱变 取20mL菌悬液离心洗涤2次,用不同浓度的硫酸二乙酯处理10、15、30min后,取0.5mL处理液,加入到4.5mL 1% Na2S2O3液中解毒,稀释后取0.1mL涂平板,37℃培养[11],计平板菌落数,分别计算存活率和正突变率。

1.2.5 原生质体制备与再生 将出发菌以2%接种量移入50mL脱脂乳培养基中37℃培养12h待凝乳,再以2%接种量移入50mL液体MRS培养基中37℃培养12h,然后以10%接种量移入50mL含有0.01g甘氨酸的液体MRS培养基中37℃培养6h,调整其OD600值在0.2左右。取上述菌液10mL于离心管中,12000r/min离心5min收集菌体,将收集到的菌体用高盐缓冲液洗涤两次,重悬于等体积高渗体系中。取一定量的菌体梯度稀释后涂布于MRS固体培养基平板计数,得到总菌落数。取5mL菌体液加入不同浓度的溶菌酶37℃水浴锅中酶解一定时间后迅速加入大量高盐缓冲稀释终止酶解反应,3000r/min离心18min去酶,用高盐缓冲液洗涤两次以清除残存酶液并重悬于等体积高渗体系中,稀释合适的倍数,涂布再生平板,得到再生菌落数。用水代替高盐缓冲液稀释等量原生质体液,涂布MRS固体培养基平板计数,得到未酶解菌落数。

原生质体形成率和再生率的计算[12]:

原生质体形成率(%)=(A-B)/A×100

原生质体再生率(%)=(C-B)/(A-B)×100

其中:A:总菌落数；B:未被酶解菌落数；C:再生菌落数。

1.2.6 原生质体紫外诱变 取2～3mL原生质体液置于放有大头针的无菌6cm培养皿中,在磁力搅拌作用下距18W紫外灯25cm处分别照射5、10、15、20、30、40、60s,对每个处理进行梯度稀释,取0.1mL涂布于再生平板培养基上,37℃避光培养,计平板菌落数,分别计算致死率和正突变率。

1.2.7 致死率和正突变率的计算 将培养好的平板取出进行菌落计数,根据平板上菌落计数结果,计算致死率；根据抑菌圈测定结果,计算正突变率[13]。

致死率(%)=(未处理平板菌落数-处理平板菌落数)/未处理平板菌落数×100

正突变率(%)=抑菌效果增大的菌落数/诱变后长出的菌落总数×100

1.2.8 高产菌株的筛选 待菌落长出后,用灭菌后牙签随机挑取单菌落至1mL MRS液体培养基中,37℃培养48h后离心取上清液,用打孔法测定其对藤黄微球菌的抑菌效果。将出发菌和抑菌圈直径较大的菌株活化,制取其类细菌素抽提液[5]。类细菌素抽提液低温保存备用,测定其抑菌活性。

1.2.9 高产菌株稳定性遗传 将筛选出的类细菌素产量突变菌株连续转接100代[14-15],分别测定各代菌株类细菌素抽提液抑菌效果,以测定其遗传稳定性。

2 结果与分析

2.1 Nisin标准曲线

由于目前对乳酸菌类细菌素的研究都尚在实验阶段,没有标准品参照,而乳酸链球菌肽(Nisin)是被美国食品和药物管理局认证的GRAS(generally recognized as safe)级别的细菌素,对其各方面的研究都较为透彻也具有权威性,本研究以Nisin效价作为参照指标,Nisin效价的对数作为纵坐标,抑菌圈直径为横坐标,做抑菌标准曲线。由图1可见,标准效价的对数与抑菌圈直径之间呈线性关系,相关系数为0.99,符合进一步实验的要求。

图1 Nisin标准效价曲线Fig.1 The standard titer curve of Nisin

2.2 60Co γ射线诱变

2.2.160Co γ射线诱变剂量的确定 菌悬液经0～3.0kGy的γ射线剂量对出发菌株NX2-6进行辐照诱变,结果如图2所示。

图2 紫外照射对菌株致死率及正突变率的影响Fig.2 Effects of 60Co γ irradiation death rate and positive mutation rate

从图2可以看出,随着γ射线辐照剂量的增加,致死率呈上升趋势,正突变率呈先上升后下降趋势。由于60Co γ能使生物染色体断裂而引起基因易位、倒位或缺失等结构变化,并对各种生物大分子造成不可修复的损伤,引起微生物遗传性状的改变[16],因此过高剂量的辐射会对菌体有明显的致死效果,并且此时的负突变率较高,不利于高产菌株的筛选。在辐照剂量为3.0kGy时,达到最大致死率为99%,但此时正突变率较低为6.1%；在辐照剂量为2.0kGy时,其致死率为58%,达到最大正突变率为8.5%,此时不但利于筛选工作的进行,而且正突变率高更利于高产菌株的获得。故2.0kGy为最佳辐照剂量。

2.2.260Co γ射线诱变的筛选结果 嗜酸乳杆菌NX2-6经60Co γ射线诱变后,随机挑取200株菌落,经过初筛和复筛得到3株高产菌γ56、γ77和γ103,参照Nisin标准效价曲线计算其抑菌效价分别为6096.78、4293.39、5065.24U/mL,比出发菌株抑菌效价(2819.36U/mL)提高了2.16、1.52、1.8倍。可以看出,经60Co γ射线诱变后的菌株较出发菌株抑菌效价有明显提高,说明所设定的照射剂量有利于高产菌株的获得,选择突变幅度最大的菌株γ56进行稳定性遗传实验。

表1 60Co γ射线诱变的筛选结果Table1 Selection for 60Co γ irradiation

2.3 DES诱变

2.3.1 DES诱变剂量的确定 菌悬液经不同浓度的硫酸二乙酯处理不同时间后取样稀释涂布于MRS平板计数,得到致死率及正突变率如图3所示。

图3 DES诱变对菌株致死率及正突变率的影响Fig.3 Effects of DES death rate and positive mutation rate

由图3可以看出,随硫酸二乙酯浓度及处理时间的增加,菌体的致死率逐渐增大；浓度为0.3%和0.5%时正突变率随处理时间的增加呈现先增加后降低的趋势,当浓度为0.7%时正突变率呈逐渐降低的趋势,可能由于高浓度的硫酸二乙酯对菌体的烷化作用[17]更为明显,短时间内就使菌体发生了诱变反应。当DES浓度为0.3%处理时间30min后,最大致死率为30%,在处理20min时,正突变率达到最大值为2.7%；当DES浓度为0.5%处理时间30min后,最大致死率为88%,正突变率在处理20min时最大为6.8%；当DES浓度为0.7%处理时间30min后,最大致死率为99.4%,在处理10min时,正突变率最大为7.8%。综合考虑,选择DES浓度为0.7%,处理菌体10min作为最佳诱变条件。

2.3.2 DES诱变的筛选结果 菌株经DES诱变后,随机挑取300株菌落,经过筛选得到3株高产菌D16、D47和D123,参照Nisin标准效价曲线计算其抑菌效价分别为3845.92、5384.98、5131.24U/mL,比出发菌株抑菌效价(2819.36U/mL)提高了1.36、1.91、1.82倍。从表2可以看出,经DES诱变后得到的高产菌较出发菌株抑菌效价有一定提高,说明所设定的诱变剂量有利于高产菌株的获得,选择突变幅度最大的菌株D47进行稳定性遗传实验。

表2 DES诱变的筛选结果Table2 Selection for diethyl sulphate mutagenesis

2.4 原生质体紫外诱变

2.4.1 原生质体制备及再生 对出发菌株原生质体制备及再生条件的摸索和优化,出发菌株的原生质体形成率达99.9%,再生率为56.2%,有较好的形成率及再生率。

2.4.2 原生质体紫外诱变剂量的确定 经原生质体化的菌株比较脆弱,因此本实验选择5～60s的紫外线照射进行诱变,结果如图4所示。

图4 原生质体诱变对菌株致死率及正突变率的影响Fig.4 Effects of protoplast mutagenesis of ultraviolet irradiation death rate and positive mutation rate

从图4可以看出,随着紫外线照射时间的延长,致死率明显上升,正突变率呈先梯度上升后下降的趋势；由于去除细胞壁后原生质体比较脆弱,因此对照射时间更为敏感。当照射时间为60s时,达到最大致死率为99.9%；当照射时间为20s时,致死率为67.9%,此时的正突变率最高为10.2%,不仅利于菌株的筛选,并且更容易获得高产菌株,故20s为实验菌株的最佳照射时间。

2.4.3 原生质体紫外诱变筛选结果 乳杆菌NX2-6经原生质体紫外诱变后,随机挑取180株菌落进行发酵,经过初筛和复筛得到3株高产菌UV6、UV27和UV156,参照Nisin标准效价曲线计算其抑菌效价分别为5441.36、5074.85、6230.79U/mL,比出发菌株抑菌效价(2819.36U/mL)提高了1.93、1.8、2.27倍。目前,不少学者利用紫外诱变筛选高产类细菌素的突变株,但是通过原生质体诱变选育优良菌株的报道还很少。由于去除了细胞壁,原生质体对诱变剂更加敏感,更容易得到优良的突变株[17]。由表3可以看出,经原生质体紫外诱变后得到的突变菌株较出发菌株抑菌效价有明显提高,说明原生质体紫外诱变是一种有效的诱变方法,并且该实验所选择的照射时间梯度有利于高产菌株的获得。选择突变幅度最大的菌株UV156进行稳定性遗传实验。

表3 原生质体诱变的筛选结果Table3 Selection for protoplast mutagenesisof ultraviolet irradiation

2.5 高产菌株遗传稳定性

选取抑菌效价增幅最大的三株高产菌γ56、D47、UV156进行遗传稳定性实验,在连续传代100代后[18],这三株菌的类细菌素抽提液对藤黄微球菌的抑菌效价如图5所示。从图中可以看出,当菌株传代100代后抑菌效价变化幅度不大,说明这三株菌有较好的遗传稳定性,可作为后续实验的出发菌株。

图5 出发菌株、γ56、D47、UV156每代的抑菌效价Fig.5 The antibacterial titer of every generation by initial strain、γ56、D47、UV156

3 结论

从自然条件筛选的野生型菌株往往产量不高,达不到生产要求,而且生产能力一般较不稳定,随着接种代数的增多,产量下降甚至丧失的情况多有发生。在工业生产中常用诱变育种的方法获得突变株,提高其产量[19]。本实验选择三种诱变方法对嗜酸乳杆菌NX2-6进行诱变,确定了每种诱变方法的最佳诱变条件,并获得三株高产菌。

60Co γ射线诱变的最佳辐照剂量为2.0kGy,获得一株类细菌素高产菌γ56,其抑菌活性为出发菌株的2.16倍；选择DES浓度为0.7%,处理菌体10min作为DES诱变最佳条件,得到一株高产菌D47,其抑菌活性为出发菌株的1.91倍；原生质体紫外诱变的最佳照射时间为20s,获得一株类细菌素高产菌UV156,其抑菌活性为出发菌株的2.21倍。通过实验数据可以看出,本实验选择的三种诱变方法中原生质体紫外诱变更适用于该菌株,可能由于去除了细胞壁后的原生质体对辐照诱变更为敏感,更容易诱变得到高产菌株。对突变株γ56、D47、UV156进行遗传稳定性实验,结果表明其遗传稳定性良好,为今后类细菌素的工业化生产奠定良好基础。

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Different mutation methods ofLactobacillusacidophilusNX2-6 for improving antifungal activity

GAO Yu-qi,DANG Li-juan,BIE Xiao-mei,LV Feng-xia,ZHAO Hai-zhen,LU Zhao-xin*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

LactobacillusacidophilusNX2-6 was mutated by60Co γ irradiation,DES and UV of protoplasts respectively,aiming to obtain high productivity of bacteriocins stains. The results showed that the optimal condition of60Co γ irradiation was 2.0kGy,the best mutant condition of DES was the concentration of 0.7% to treat bacteria for 10min,and the UV of protoplasts best irradiation time was 20s. Then high productivity strains γ56,D47and UV125were screened respectively. Moreover,their antibacterial titers were 6096.78,5384.98U/mL and 6230.79U/mL. The antibacterial titers of γ56,D47,UV156was 2.16,1.91,2.21 times than the initial strain(2819.36U/mL)respectively. The bacteria passage test indicates that mutant strains γ56,D47,UV156have the sTableheredity.

60Co γ irradiation;diethyl sulphate mutagenesis;protoplast mutagenesis of ultraviolet irradiation；stability

2014-07-09

高钰淇(1990-)，女，在读硕士研究生，研究方向：微生物代谢与发酵工程。

国家科技部支撑计划(2011BAD23B05)。

TS202.3

A

:1002-0306(2015)09-0184-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.032

*通讯作者:陆兆新 (1957-)，男，博士，研究方向：酶工程、食品微生物、农产品加工。