超嗜热细菌Thermotogamaritima酯酶Tm1350克隆、表达及其酶学性质研究

魏 涛,杜聪聪,毛多斌,马歌丽

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州 450002)



超嗜热细菌Thermotogamaritima酯酶Tm1350克隆、表达及其酶学性质研究

魏 涛,杜聪聪,毛多斌,马歌丽*

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州 450002)

以超嗜热细菌Thermotogamaritima基因组DNA为模板,通过PCR法扩增酯酶Tm1350基因,构建重组质粒pET15b-Tm1350,在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中实现表达,并采用p-NPA方法测定其酶活性。研究结果表明,酯酶Tm1350可以水解不同碳链长度(10C)的对硝基苯酚酯,其中对硝基苯酚戊酸酯(pNP-C5)是该酶最适合底物；该酶最适反应温度和pH分别为70℃和6.5,90℃处理5h,仍有50%以上的酶活力,具有较强的热稳定性。酯酶Tm1350对金属离子、抑制剂、变性剂和有机溶剂具有较强的抗性。

Thermotogamaritima,酯酶,克隆表达,酶学性质

酯酶(Esterases,EC 3.1.1.1)是一种能够参与酯化、转酯和酯交换等多种反应,并能水解多种含酰胺键、羧酯键和硫酯键的内源性及外源性物质的丝氨酸水解酶类[1-2]。酯酶作为一种高效的生物催化剂在精细化工、食品加工、医药工业、皮革制造、化妆品行业和污水整治等行业发挥着重要的作用[3-7]。然而,工业酶通常需要在高温或有机相条件下发生催化反应,常温酶在极端条件下的应用受到限制,因此提高酶的热稳定性和催化活性成为酶催化领域研究的热点[8-9]。嗜热酯酶具有良好的热稳定性和环境抗性,是生物催化领域新型的酶催化剂[10-12]。

超嗜热菌海栖热袍菌Thermotogamaritima是一种发现于55～90℃海底火山口周围的严格厌氧菌,最适生长温度在80℃左右[13]。生物信息学与基因组学研究发现,嗜热菌海栖热袍菌T.maritima基因组中含有多个羧酸酯酶的基因。本研究将来自T.maritima的酯酶基因Tm1350在大肠杆菌中进行克隆表达,并进行了酶学性质研究,以期为工业化生产提供一种新型的嗜热酯酶催化剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

T.maritima基因组DNA 南京农业大学保存；表达载体pET-15b、菌株EscherichiacoliBL21(DE3)、E.coliDH5α 本实验室保存；Pyrobest酶、DNA 连接酶、限制性内切酶NdeI、SalI 购自TAKARA生物科技公司；1kb DNA Ladder、Protein MW Marker 购自Fermentas公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 购自北京TIANGEN公司；Ni-NTA亲和层析系统 购自GE Healthcare；对硝基苯酚酯 购自美国sigma公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。

PCR仪 Thermo公司；低温离心机 美国Sigma-Aldrich公司；凝胶成相系统 Syngene公司；Y92-Ⅲ超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-2600系列紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；LDZX型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；QYC 211恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司；pH计 德国赛多利斯股份公司；DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 酯酶Tm1350氨基酸序列同源性分析 利用NCBI Blast和Clustal W软件,对T.maritima酯酶Tm1350及其同源蛋白氨基酸序列进行比对分析。

1.2.2 引物设计与合成 根据GenBank中酯酶Tm1350的氨基酸序列,利用Genetyx软件设计引物如下(下划线部分表示限制性内切酶NdeI和SalI的酶切位点):(F)5′-CGACCATATGAGAATGAA CATCCAGAAAC-3’(NdeI)和(R)5′-AGGCGTCGAC TTATTTCCCTCCGAGTTTTTCGAG-3′(SalI),由上海生工公司合成。

1.2.3T.maritima酯酶Tm1350的基因克隆 以提取嗜热细菌T.Maritima基因组DNA为模板,PCR方法(100μL)扩增酯酶Tm1350基因。扩增条件:预变性:94℃,5min；变性:94℃,30s；退火:45s；延伸:72℃,2min；循环(30个)；延伸:72℃,10min。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳进行检测,并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。将纯化目的基因片段与载体pET15b连接,构建重组质粒pET15b-Tm1350并送上海生工公司测序。

1.2.4 重组蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化 将重组质粒pET15b-Tm1350转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,涂布至加入氨苄青霉素(Amp,100μg/L)和氯霉素(Chl,34μg/L)的LB平板上,37℃培养12～16h。挑取阳性转化子单菌落于5mL含Amp和Chl的LB液体培养基中,培养12h；按2%接种量接种到含Amp的300mL LB液体培养基中,培养2～3h,使OD600在0.4～0.6；加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L,诱导表达蛋白；离心收集菌体,加入20mL破壁buffer(50mmol/L Tris-HCl,pH8.0,50mmol/L NaCl),超声波破碎菌体后75℃热处理30min；4℃,12000×g离心10min,上清即为蛋白粗酶液。采用镍柱亲和层析方法进行目的蛋白的纯化,并利用蛋白质电泳(SDS-PAGE凝胶电泳)来检测纯化效果。蛋白质浓度用考马斯亮蓝比色Bradford方法测定。

1.2.5 酶活力的测定 酯酶活性测定采用p-NPA法[14-15]。酶活力单位定义为:在70℃和pH6.0条件下,每分钟水解底物生成1μmol的对硝基苯酚所用的酶量为一个活力单位(U)。

1.2.6 重组酯酶Tm1350酶学性质研究

1.2.6.1 底物特异性 分别以硝基苯基乙酸酯(pNP-C2)、对硝基苯基丁酸酯(pNP-C4)、对硝基苯酚戊酸酯(pNP-C5)、对硝基苯基辛酸酯(pNP-C8)、对硝基苯基葵酸酯(pNP-C10)、对硝基苯基月桂酸酯(pNP-C12)和对硝基苯基棕榈酸酯(pNP-C16)为反应底物,配制相同浓度底物(10mmol/L),于标准反应体系中测定酶活,测定酯酶Tm1350的底物特异性。

1.2.6.2 最适反应温度与热稳定性 最适温度测定:以10mmol/L对硝基苯酚戊酸酯作为反应底物,缓冲体系为50mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH6.5),反应时间为30min。在30～100℃范围内,每隔5℃测酶活。酶的热稳定性:取相同浓度的酶置于不同温度(70、80和90℃)下,分别保温0～5h后,在标准体系下检测酶活力。

1.2.6.3 最适反应pH 在不同pH(3.0～9.0)的缓冲液下测酶活。所用缓冲液为50mmol/L的柠檬酸钠缓冲液(pH3.0～4.0)、醋酸钠缓冲液(pH4.5～6.0)、磷酸钠缓冲液(pH6.5～8.0)和Tris-HCl缓冲液(pH8.5～9.0)。反应温度为70℃,底物为对硝基苯酚戊酸酯,对照不加酶,以相应pH的缓冲液代替。

1.2.6.4 金属离子、抑制剂及变性剂对酶活力的影响 在标准反应体系中分别加入不同的金属离子溶液(Ni2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Ca2+、Pb2+和Cu2+)或EDTA至终浓度为5mmol/L,室温放置60min,以对硝基苯酚戊酸酯为底物,以不加任何金属离子的酶促反应物为对照,70℃反应测酶活。取稀释酶液(10μg)分别加入体积比为1%和5%变性剂(Tween 20、Tween 80和SDS)以及5mmol/L抑制剂(PMSF、DEPC和DTT),处理30min后,将混合物加入标准酶催化反应体系中进行反应。

1.2.6.5 有机溶剂对酶活力的影响 取20μL稀释酶液(10μg)分别加入体积分数为50%或90%的有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、正己烷和DMSO)处理2h后,加入标准酶催化反应体系,以不经有机溶剂处理的酶促反应物为对照,测定酶活。

2 结果与讨论

2.1 酯酶Tm1350氨基酸序列分析

NCBI网站中Blast分析嗜热酯酶Tm1350的同源序列,发现在嗜热细菌ThermococcusgammatoleransEJ3、Thermotoganeapolitana和嗜热古菌Pyrocococusfurious、PyrococcusabyssiGE5和FervidobacteriumnodosumRt17-B1等中存在同源蛋白,相似性介于62%～68%之间,利用软件Clustal W2.1比对酯酶Tm1350的同源序列,结果如图1所示,在该酯酶家族中存在LFGHSLGGL保守结构域；Ser103、Asp183和His249为嗜热酯酶Tm1350可能的催化活性中心,组成该酶的催化三联结构。

图1 Tm1350的序列比对及同源性分析Fig.1 Multiple sequence alignmentfor Tm1350 and its homologs注:右边序号代表氨基酸的位置；阴影部分为保守序列；“*”、“:”、“.”分别代表保守的和半保守氨基酸位点；“▲”代表催化活性中心；方框部分代表保守结构域；Tm1350:Thermotoga maritima(WP_010865324)；TGAN_0950:Thermococcus gammatolerans EJ3(WP_015858566)；PF0480:Pyrocococus furious(WP_011011597)；PAB1050:Pyrococcus abyssi GE5(WP_010868712)；Fnod_1513:Fervidobacterium nodosum Rt17-B1(WP_011994661)；CTN_1241:Thermotoga neapolitana DSM 4359(WP_015919732)。

2.2 嗜热酯酶Tm1350基因克隆及表达

以T.maritima基因组DNA为模板,PCR扩增片段与预期大小基本相符(780bp)。重组质粒pET15b-Tm1350经NdeI和SalI双酶切和DNA测序分析,嗜热酯酶Tm1350成功克隆到载体pET15b。重组质粒pET15b-Tm1350在大肠杆菌BL21(DE3)表达后,经超声波破壁、70℃热处理和镍柱亲和层析,得到纯化重组酯酶Tm1350的单一条带。经过考马斯亮蓝比色法测定蛋白浓度,纯化后酶浓度约为25μg/mL(酶浓度浓度标准曲线方程Y=1.0601X-0.025,R2=0.9987)。由SDS-PAGE结果,推测该酶分子量约为28ku,与预期分子量(氨基酸计算)基本一致。

2.3 酯酶Tm1350酶学性质的研究

2.3.1 酯酶Tm1350的底物特异性 以不同链长的对硝基苯基酯底物,检测酯酶Tm1350的底物特异性。由图3可知,该酶水解碳链长度小于10对硝基苯酚酯的活力较强,即pNP-C5>pNP-C8>pNP-C4>pNP-C2>pNP-C10>pNP-C12>pNP-C14>pNP-C16,其中最适水解底物为pNP-C5(对硝基苯酚戊酸酯)(135.31U/mg)。底物特异性实验结果表明,Tm1350在分类上属于真酯酶,不属于脂肪酶[14]。

图2 SDS-PAGE检测重组蛋白在E. Coli BL21中的表达和纯化Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression and purification of the recombinant esterase注:M:蛋白Marker；1:菌体超声破碎后全蛋白；2:热处理并离心后上清粗蛋白；3:镍柱亲和层析纯化后蛋白。

图3 酯酶Tm1350底物特异性Fig.3 The substrate specificity of Tm1350 towards different pNP-esters

2.3.2 酯酶Tm1350最适反应温度与热稳定性 温度对酶活的影响包括两方面内容:酶的最适温度和热稳定性。如图4所示,酯酶Tm1350最适合反应温度为70℃,且该酶在30～100℃较宽温度范围内都有50%以上的活性。热稳定性实验表明,在90℃处理5h,仍然保持50%以上的活性(如图5),说明该酶的热稳定性非常强。

图4 酯酶Tm1350最适反应温度Fig.4 Optimum temperature of the esterase Tm1350

2.3.3 酯酶Tm1350最适反应pH 如图6所示,酯酶Tm1350最适pH为6.5,与已报道嗜热酯酶的最适pH(6～8)基本相符[1]。

图5 酯酶Tm1350热稳定性Fig.5 Thermostability of the esterase Tm1350

图6 酯酶Tm1350最适反应pHFig.6 Optimum pH of the esterase Tm1350

2.3.4 金属离子及抑制剂对嗜热酯酶Tm1350酶活力的影响 检测不同金属离子(5mmol/L)对酶活的影响,包括Ni2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Ca2+、Pb2+和Cu2+。结果如表1所示,Ba2+和Mg2+对酶活的影响较小,而Ni2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+、Pb2+和Cu2+对酯酶Tm1350活性有不同抑制作用,相对酶活分别降至原来的63%、59%、47%、43%、41%和14%。5mmol/L的金属螯合剂EDTA对酶活也没有明显影响,说明该酶不属于金属依赖型的酶。在5mmol/L 还原剂DTT作用下,该酶保持13% 活性；抑制PMSF和DEPC(5mmol/L)对酶活性具有明显抑制作用(为起始酶活的51%和完全抑制),说明丝氨酸和组氨酸残基在酶的催化过程中起重要作用,这与氨基酸序列分析结果一致[1]。

表1 金属离子及抑制剂对嗜热酯酶Tm1350酶活力影响Table1 Effect of metal ions and inhibitors on the enzyme activity of the esterase Tm1350

2.3.5 有机溶剂及变性剂对嗜热酯酶Tm1350酶活力的影响 在许多工业生产中都用到有机溶剂,因此有机溶剂对酶活的影响非常重要。表2是不同的有机溶剂对酶活性的影响。如表2所示,甲醇、乙醇、丙酮、正己烷和DMSO在体积比为50%和90%时对酶活的影响不大,只有90%氯仿抑制酶活到原来酶活的33%。变性剂SDS、Tween-20和TritonX-100(1%或5%,w/v)对酯酶Tm1350活性影响不明显。酯酶Tm1350在多数有机溶剂中比较稳定,这使其能够在生物催化反应中具有重要应用前景。

表2 有机溶剂及变性剂对嗜热酯酶Tm1350酶活力的影响Table2 Effect of organic solvents and detergents on the enzyme activity of the esterase Tm1350

3 结论

本文将来自超嗜热细菌T.maritima嗜热酯酶Tm1350在E.coliBL21(DE3)中成功克隆表达,通过IPTG诱导表达蛋白、超声破碎、热处理和镍柱亲和层析,得到纯化的重组酶。SDS-PAGE分析表明,该酯酶分子量约28ku。酶学性质研究表明,该酯酶对不同硝基苯酚酯底物具有不同水解活性,活性大小为pNP-C5>pNP-C8>pNP-C4>pNP-C2>pNP-C10>pNP-C12>pNP-C14>pNP-C16,其中pNP-C5(对硝基苯酚戊酸酯)为该酶最佳水解底物；酯酶Tm1350最适反应温度和最适作用pH分别为70℃和6.5,该酯酶于90℃处理5h,仍有50%以上的酶活力,具有较强的热稳定性。酯酶Tm1350对有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、正己烷和DMSO)和变性剂(SDS、Tween-20和TritonX-100)表现出较强的抗性,因此在生物催化中具有广阔的开发应用前景。

[1]Levission M,Vander OJ,Kengen SWM.Carboxylic ester hydrolases from hyperthermophiles[J].Extremophiles,2009,13(1):567-581.

[2]Wei T,Feng SX,Mao DB,et al.Characterization of a new thermophilic and acid tolerant esterase from Thermotoga maritima capable of hydrolytic resolution of racemic ketoprofen ethyl ester[J].J Mol Catal B:Enzym,2013,85(1):23-30.

[3]王顺民,董文宾.嗜热酶的研究及其在食品等相关工业的应用[J].自然杂志,2004,26(6):339-341.

[4]龙彪,饶国华,彭志英,等.食品应用新酶源-极端酶[J].中国食品添加剂,2005,3(3):47-49.

[5]Barriuso J,Prieto A,Martinez MJ.Fungal genomes mining to discover novel sterol esterases and lipases as catalysts[J].BMC Genomics,2013,14:712.

[6]Margolin AL.Enzymes in the synthesis of chiral drugs[J]. Enzyme Microb Technol,1993,15(6):266-280.

[7]韩波,姚安庆,王勇,等.应用植物酯酶测定农药残留研究进展[J].长江大学学报:自然科学版,2009,6(3):60-65.

[8]陈路清,张秀艳,唐彦捷,等.嗜热酶的稳定机制和稳定策略的研究进展[J].科技通报,2008,24(6):792-798.

[9]王秋岩.嗜热酯酶APE1547催化活性的定向进化研究[J].微生物学报,2006,46(6):259-262.

[10]Gross R A,Kumar A,Kalra B.Polymer synthesis byinvitroenzyme catalysis[J].Chem Rev,2001,101(11):2097-2124.

[11]Atomi H,Imanaka T.ThermosTablecarboxylesterases from hyperthermophiles.[J].Tetrahedron:Asymmetry,2004,15(7):2729-2735.

[12]刘爱民,黄为一.极端酶的研究[J].微生物学杂志,2004,24(6):47-50.

[13]Nelson KE,Clayton RA,Gill SR,et al.Evidence for lateral gene transfer between archaea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima[J].Nature,1999,399(6734):323-329.

[14]Kakugawa S,Fushinobu S,Wakagi T,et al.Characterization of a thermostat-able carboxylesterase from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,74(23):585-591.

[15]Gutiérrez-Fernández J,Vaquero ME,Prieto A,et al.Crystal structures of ophiostoma piceae sterol esterase:structural insights into activation mechanism and product release[J].J Struct Biol,2014,187(3):215-22.

Cloning,expression and characterization of the esterase Tm1350 from hyperthermophilic bacteriaThermotogamaritima

WEI Tao,DU Cong-cong,MAO Duo-bin,MA Ge-li*

(School of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China)

The esterase gene Tm1350 fromThermotogamaritimawas amplified by PCR method and recombinant plasmid pET15b-Tm1350 was constructed to express the enzyme inEscherichiacoliBL21(DE3). Esterase activity was determined spectrophotometrically by the p-NPA method using p-nitrophenyl esters of various chain lengths as the substrates. The enzyme could hydrolyze the substrates of pNP-esters with acyl chains of different lengths and exhibited the highest activity for pNP-C5 among the substrates tested. Tm1350 displayed optimal activity at 70℃ and 6.5. It maintained above 50% activity after 5h incubation at 90℃,which indicated that the enzyme showed strong thermal stability. The recombinant esterase Tm1350 was found to have strong resistances to metal ions,inhibitor,denaturant and organic solvents.

Thermotogamaritima;esterase;cloning and expression;enzymatic property

2014-07-25

魏涛(1980-)，男，博士，副教授，研究方向：食品酶技术。

*通讯作者:马歌丽(1962-)，女，硕士，教授，研究方向：酶工程。

河南省重点科技攻关项目(132102120197)。

TS201.3

A

:1002-0306(2015)09-0179-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.031