高效液相色谱-串联质谱法同时筛查人尿中40种世界反兴奋剂机构禁用药物

申 利



高效液相色谱-串联质谱法同时筛查人尿中40种世界反兴奋剂机构禁用药物

申 利

运用酸水解-液液萃取及直接液液萃取相结合的方法对尿样进行前处理，建立了同时筛查WADA《禁用清单》中β-阻断剂和麻醉剂，部分刺激剂及β2-激动剂的检测方法。涵盖药物40种，检出限范围分布在0.1～10 ng/mL，在低浓度、WADA技术文件要求最低检测浓度(MRPL)和高浓度时相对回收率分布在1.6%～118.6%。解决了实验室原有方法不能达到技术文件MRPL的问题，在快速筛查尿样时效果良好。方法灵敏、简单、经济、快速，结果准确可靠。

高效液相色谱-质谱联用；β-阻断剂；麻醉剂；刺激剂；β2-激动剂；多重反应监测

1 前言

世界反兴奋剂机构(以下简称“WADA”)每一年度都会颁布即时的《禁用清单》，涵盖的禁用物质包括12大类，禁用物质原型总数超过200个。实际工作中除检测禁用物质外，还要求检测其各级代谢物和相关化合物及其代谢物，整个实验室需定性检出的化合物总数超过400个[12]，这就要求实验室的初筛应尽可能的用一种方法同时定性检出较多的药物。在《禁用清单》中，WADA 规定禁用β-阻断剂20个，麻醉剂11个，刺激剂66个，β2-激动剂6个，中国反兴奋剂中心检测实验室先前检测这些禁用物质是采用了传统的气相色谱/质谱联用(GC/MS)技术[1,7,8,9],方法可满足以前的要求。近年来，WADA技术文件[11]对检测灵敏度的要求越来越高，新版本对各类禁用物质的最低检测浓度要求(MRPL)均有很大的提高，有些物质的MRPL甚至是原来的1/10。本实验室原有的检测方法已不能达到WADA技术文件的要求，日常检测及WADA外部质量控制评估计划工作中存在着极大的隐患。本研究即选取40种禁用物质作为研究对象建立新的检测方法。这些药物的共同特征为：1)现有实验室检测方法不能全部满足技术文件要求；2)原形和/或其代谢物为以结合型(葡萄糖醛酸甙或硫酸酯)和游离型两种形式，但主要以结合形式在尿中存在[2]；3)分子极性较大，不易挥发，GC/MS检测需先进行衍生化，尿样前处理步骤繁琐。

近年来，液相色谱-质谱联用技术(HPLC/MS)日渐成熟，在分析化学领域取得了大范围的应用，越来越多的兴奋剂检测实验室采用液质方法[3-5]进行这几类物质的检测。但WADA各实验室禁用物质分类和尿样前处理步骤各行其道，所用仪器也不尽相同[4,6,10]。为了保持我实验室在兴奋剂检测领域的检测资格和技术领先地位，保证检测结果的准确可靠，进行液质检测方法的研究十分必要。本研究选取了所有β-阻断剂和麻醉剂，以及7个刺激剂和3个β2-激动剂作为研究对象，充分利用了实验室现有的仪器和试剂，运用盐酸水解-液液萃取及直接液液萃取相结合的方法对尿样进行前处理，利用高效液相色谱-串联四级杆质谱联用技术，建立了同时筛查WADA禁用清单中β-阻断剂和麻醉剂，部分刺激剂及β2-激动剂的检测方法。

2 实验部分

2.1 仪器和设备

6410 Triple Quad LC-MS：美国Agilent公司产品；色谱柱：Agilent Zorbax XDB-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm×3.5 μm)，美国Agilent公司产品；电子天平：瑞士Mettler Toledo公司产品；Dri-block DB-3D氮气吹干装置：美国Techne公司产品；低速离心机：美国Thermo公司产品；低温恒温液浴循环两用槽：杭州雪中炭恒温技术有限公司产品；超纯水机：美国Millipore公司产品；振荡器：德国Gmbh&Co.KG公司产品； Finnpipette系列取液器：美国Thermo-Finnpipette公司产品。电热鼓风干燥箱：国产。

2.2 试剂与材料

标准品来源见表1。

表1 本研究实验对象及禁用物质标准品来源一览表Table 1 The Subjects and Source of Reference Standards

注：乙腈、甲醇、甲酸胺、甲酸(色谱纯):DIKMA TECHNOLOGY Inc.美国。L-半胱氨酸(L-Cysteine)及其余均为国产分析纯试剂。

2.3 阳性尿的配制

准确称取各种禁用物质的标准品1 mg，配制成1 mg/mL甲醇溶液作为标准储备溶液，再以甲醇为溶剂倍比稀释成10 ng/μL 的标准品溶液备用。按照表1中各类禁用物质的MRPL要求，准确量取标准品溶液，分4组配制成混合标准溶液，量取该溶液，加入3 mL空白尿样，按照各自的MRPL配成混合控制尿样。

2.4 实验方法

2.4.1 样品前处理

1.尿样3 mL,加10 μL内标甲醇溶液(甲基睾酮，10 ng/μL)，加入约50 mg L-半胱氨酸和0.2 mL浓盐酸(约14 mol/L)，100℃水解30 min，冷却后加0.25 mL 12 mol/L NaOH溶液中和，再加入约1.5 g固体缓冲剂(NaHCO3/K2CO3=3/2,w/w,pH=9.6)和3 mL提取液(乙醚/异丙醇=9/1,v/v)萃取，留取有机相备用。

2.尿样3 mL,加10 μL内标甲醇溶液(甲基睾酮，10 ng/μL)，加入约1.5 g固体缓冲剂和3 mL提取液萃取，留取有机相备用。

3.合并1和2的有机相，60℃氮气流下吹干，用初始流动相溶解定容至500 μL，进样10 μL 于LC-MS/MS。

2.4.2 实验条件

1.色谱条件：Agilent Zorbax XDB-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm×3.5 μm)；柱温40 ℃；流动相采用pH 3.5的甲酸胺缓冲液(A)和乙腈(B)进行梯度洗脱；洗脱梯度：0～1 min:95%A～5%B，1～7 min:30%A～70%B；7～8 min:0%A～100%B，9 min:0%A～100%B。流速0.4 mL/min，运行9 min，平衡4.5 min；进样量10 μL。

2.质谱条件：多反应离子监测(MRM)；离子化方式：电喷雾(ESI)；离子极性：正离子模式；毛细管电压：4 000 V；干燥器温度：330 ℃；干燥器流速：10.0 L/min；定性分析采用离子对(母离子和两个子离子)信息比较和保留时间比较。

3 结果与讨论

3.1 质谱条件的选择

根据此类物质的结构特征，选择正离子模式。通过对各个禁用物质单标溶液分别进样进行一级质谱扫描，确定其准分子离子峰，并分别优化每种物质的锥孔电压。分别以其准分子离子峰为母离子，通过不同的碰撞电压产生碎片进行二级质谱扫描，选择丰度较高的两个碎片离子作为定性特征离子，同时优化其碰撞能量。鉴于采集的离子对较多，为了保证检出灵敏度，质谱检测在0～5 min，5～9 min进行分段采集(表2)。

表2 本研究禁用物质检测的色谱及质谱条件一览表Table 2 HPLC-MS/MS Conditions

3.2 色谱条件的优化

综合文献[3,5]以及实验结果，选择乙腈/水作为流动相体系。在流动相中添加缓冲盐调节系统的pH值。由于本研究的目的侧重用较短的时间尽量分析较多的物质和较多的样品，而涉及的禁用物质分子量大小分布范围较宽，保留情况各不相同，所以，通过不同的洗脱梯度比较，确定了乙腈的起始浓度为5%，最终浓度为100%，运行时间为9 min的梯度洗脱条件，通过调节不同时间段内的流动相配比，尽量使40种禁用物质达到比较良好的分离。由于兴奋剂检测工作要求快速出结果，所以，选用了较短的色谱柱，较短的运行时间，而初筛采用的MRM模式减少了各个禁用物质定性离子间的相互干扰，即使在色谱分离不理想的情况下，也能得到较好的分析结果(表2)。

3.3 尿样前处理方法的选择

文献报道[2]本研究涉及的3种β2-激动剂几乎全部以硫酸酯结合形式存在于尿中，实验中发现，从尿中提取前需进行酸水解方可游离出检测物质。试验中涉及的麻醉剂和刺激剂及β-阻断剂在尿中排泄时的结合方式为葡萄糖醛酸甙结合，实验表明，酸水解、酶水解均可较好地游离出检测物，为了同时检出这些物质，最后选择成本较低，操作简单的酸水解方法。实验中发现，bisoprolol,atenolol，pindolol，timolol,esmolol,dextromoramide,methadone,oxycodone,pethidine等禁用物质在强酸条件下可能被破坏，所以，采用了另取一份尿样直接提取后与水解后提取的样品合并的方法，兼顾到了所有涉及到的物质，结果较为理想。

3.4 方法的回收率和检出限

1.按照每种药物的20% MRPL，MRPL和500% MRPL配制相应浓度的控制尿样各10份，按照前述方法进行前处理，与等量的标准品溶液平行进样，提取各个药物的丰度较高的子离子积分得到峰面积，比较得出提取回收率(平均值，表3)。

2.配制一系列较低浓度的控制尿样，按照前述方法进行前处理，提取后进样，提取丰度较低的子离子，根据信噪比计算得出禁用物质的尿中检出限(S/N=5，表3)。

表3 本研究药物的回收率和检出限一览表Table 3 The Limits of Detection and the Recoveries at Different Concentrations

续表 3

注：* Benzoylecgonine为cocaine的主要代谢物，为尿中的必要检测物质，本方法对此物质的提取回收率极低，但由于其良好的质谱响应，使得2%的回收率仍能获得4 ng/mL的尿中检出限，满足检测初筛要求，如果初筛检测尿样中发现此物质疑似阳性，进行确证时本实验室采取不同的提取方法。这也符合WADA的技术文件要求。

部分禁用物质在20% MRPL浓度时的MRM图见图1。

图1 本研究20% MRPL 浓度下部分禁用物质的MRM示意图Figure 1. The MRM Chromatograms of Several Prohibited Substances at 20% MRPL Concentration

3.5 精密度

选取了benzoylecgonine,ethamivan,fentanyl,metoprolol,nadolol,propranolol和terbutaline等7种较为易得的禁用物质进行方法的精密度实验，这7种物质保留时间和提取回收率分布在不同区域，也是阳性率较高或检出较为困难的禁用物质。配置20% MRPL浓度、MRPL浓度和500% MRPL浓度的控制尿样，分别由2名实验人员各取5份平行进行分析，提取丰度较高的子离子积分得到峰面积，计算其CV得到日内精密度。按照日内精密度的操作方法，每天进行1次实验，共3天，计算CV 得到日间精密度。结果均小于15%，符合技术文件要求，证明本检测方法稳定可靠。

3.6 基质干扰

收取50份空白尿样，按照本研究中方法进行化学前处理及LC-MS/MS检测分析，观察待测离子窗口，所有窗口均无明显干扰。

3.7 实际样品检测

目前，本实验室已经采用此方法对实验室的所有常规样品进行检测，发现本研究开发的LC-MS/MS方法检测阳性质控样品结果准确无误，离子清晰易见，阴性样品在所有窗口均无明显干扰。到目前为止，检测样品超过2万例，检出包括WADA 外部质量评估计划样品在内的阳性样品数10例，初筛结果灵敏度高，干扰小，图谱清晰。

4 结论

本研究建立的液相色谱-串联质谱同时检测40种WADA禁用物质的方法，选择性好，灵敏度高。与原有的气相色谱/质谱联用方法比较，具有以下优势：1)灵敏度大幅提高，完全满足了WADA最新的最低检测要求(MRPL)；2)无需进行衍生化，前处理方法简化，时间缩短了1 h以上，降低了工作量，减低了工作人员因为接触衍生化试剂而潜在的健康威胁；3)对每一个样品而言，仪器分析时间缩短了10 min，这对兴奋剂检测工作的时效性十分重要；4)方法选择性好，无干扰，结果一目了然，降低了结果处理的工作强度；5)消除了实验室检测工作中的重大隐患。

[1]徐友宣，张长久，申利，等.Beta-阻断剂确认方法的研究[J]，高等学校化学学报，1995,16(1):75.

[2]曾苏.药物代谢学[M].杭州：浙江大学出版社，2008:35-45.

[3]DEVENTERK,VAN E，DELBEKE F T.Simultaneous determination of beta-blocking agents and diuretics in doping analysis by Liquid chromatography/mass spectrometry with scan to scan polarity switching[J].Rapid Commun Mass Spec,2005,19(2):90-98.

[4]MARIO T,ANDREAS T,WIHELM S.Current role of LC-MS(/MS) in doping control[J],Anal Bioanal Chem,2011,401(2):405-420.

[5]MAZZARINU M,DE L T R，BOTRE F.A screening method for the simultaneous detection of glucocorticoids,diuretics,stimulants,anti-oestrogents,beta-adrenergic drugs and anabolic steroids in human urine by LC-ESI-MS/MS[J].Anal Bioanal Chem，2008，392(4):681-698.

[6]MAZZARINO M，DE LA TORRE X，BOTRF，etal.A Rapid Screening LC-MS/MS Method Based on Conventional HPLC Pumps for the Analysis of Low Molecular Weight Xenobiotics:Application to Doping Control Analysis[M].Drug Testing Analysis，2010:311-322.

[7]SOLANS A,CARNICERO M，DE L T R,etal.Comprehensive screening procedure for detection of stimulants,narcotics,adrenergic drugs,and their metabolites in human urine[J].J Anal Toxicol，1995，19(2):104-114.

[8]SHEN L,CUI K，WU M.Screening and Confirmatory Analysis of Fenoterol,Bambuterol and Its Metabolites in Human Urine by GC-MS[M].Sport Büch Strauβ Köln，2003:101-107.

[9]STRANO S R,COLAMONIC C，BOTRE F P.Analysis of stimulants in saliva and urine by gas chromatography-mass spectrometry perspectives for “in competition” anti-doping analysis[J].Anal Chim Acta，2008，606:217-222.

[10]VIRUS E D,SOBOLEVSKY T G，SEMENISTAYA E N,etal.Development and Validation of a General Screening Method for Doping Substances in Human Urine by HPLC/Orbitrap Mass Spectrometry[M].Sport Büch Strauβ Köln，2011:154-157.

[11]WORLD ANTI-DOPING AGENCY.Technical document for minimum required performance levels[EB/OL].https://www.wada-ama.org/en/resources/science-medicine/td2014-mrpl.

[12]WORLD ANTY-DOPING AGENCY.The world anti-doping code.The 2015 prohibited list international standard[EB/OL].https://www.wada-ama.org/en/resources/science-medicine/prohibited-list.

Simultaneous Detection of 40 WADA Prohibited Substances in Human Urine by High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

SHEN Li

A high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry method was developed for a simultaneous detection of 40 prohibited substances,covered β-blockers and narcotics,some stimulants and β2-agonists which are included in the prohibited list issued by the World Anti-Doping Agency (WADA).After the pretreatment with acid hydrolysis,extraction and enrichment procedures,the urine sample was injected to the LC-MS/MS.The limits of detection were between 0.1～10 ng/mL according to different substances.The spiked recoveries at low concentration,WADA Minimum Required Performance Levels (MRPL) and high concentration were within the range of 1.6% to 118.6%.This method was a simple,fast,effective and reliable solvent to our laboratory and now has been successfully applied to the routine analysis and the External Quality Assessment Scheme set out by WADA.

highperformanceliquidchromatography-massspectrometry;β-blockers;narcotics;stimulants;β2-agonist;multiplereactionmonitoring

1000-677X(2015)05-0066-05

10.16469/j.css.201505009

2014-12-02；

2015-03-16

国家体育总局重点领域研究课题(2013B002)。

申利(1969-)，女，河北石家庄人，副研究员，硕士，主要研究方向为兴奋剂检测新方法，Tel：(010)84376803，E-mail：shenli@chinada.cn。

国家体育总局 反兴奋剂中心，北京 100029 China Anti-doping Agency,Beijing 100029,China.

G804.7

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