细胞穿透肽增强抗肿瘤效果的研究进展

马中林，　开振鹏，　吴范宏

细胞穿透肽增强抗肿瘤效果的研究进展

马中林，开振鹏，吴范宏

(上海应用技术学院化学与环境工程学院，上海201418)

细胞穿透肽(CPPs)是一种能够穿透细胞膜的多肽，可携带多种物质进入细胞内，并产生生理活性.现有一些抗肿瘤药物由于其本身的水溶性差、活性低、毒性大和易产生耐药性等缺陷，影响了肿瘤治疗效果.综述了近几年来细胞穿透肽增强抗肿瘤效果的研究进展，为更好地寻求治疗肿瘤药物的给药途径提供新思路.

细胞穿透肽；内吞作用；药物输送；偶联物；抗肿瘤

细胞膜作为细胞与外界环境之间的屏障，可以阻断大分子物质及亲水性物质自由通过.通常情况下，生物大分子需要通过特定的通道或质膜泵才能穿过细胞膜.因此，对于难以穿透细胞膜的治疗药物需要寻找一条安全有效的给药途径.

现有的一些抗肿瘤药物由于自身缺陷，如水溶性差，难以穿透细胞膜，存在多药耐药性，限制了其在临床试验上的应用.而抗肿瘤药物与细胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides，CPPs)通过共价键或非共价键连接，形成偶联化合物，可以增强穿透细胞膜的性能，使药物能够进入细胞内，达到治疗肿瘤疾病的目的.之前报道过CPPs的研究进展涉及到多肽、蛋白质、寡核苷酸、纳米材料、脂质体和小分子药物等多方面[1-2]，单独涉及抗肿瘤药物的研究进展还未被报道.本文就近年来有关小分子抗肿瘤药物与CPPs形成偶联物的研究进展进行综述.

1　细胞穿透肽

CPPs是一种能够穿透细胞膜的多肽，又称为蛋白转导域或膜转导肽.CPPs氨基酸个数一般不超过30个，从1988年第一个CPPs(Tat)被报道[3]，至今已超过300个CPPs被发现，一部分来源于自然界，另一部分通过人工合成.根据CPPs结构特征，可将其分为两类：富含精氨酸和两亲性CPPs[1].其后研究发现，一些新型多肽按功能可分为肿瘤归巢肽、线粒体穿透肽、可活化细胞穿膜肽和嵌合肽等多种CPPs[4].体外和体内实验证明，CPPs具有较好的将外界药物带入细胞的功能，且本身无细胞毒性，在疾病诊断和治疗过程中取得了很好的效果；尤其对体内蛋白和多肽具有转运作用，故CPPs在很多医学领域得到广泛应用，且已有CPPs用于临床前和临床研究[5].

2　CPPs的穿透机理

CPPs组成和结构的多样性导致其穿透细胞膜的方式不一[6].最初认为CPPs穿透细胞膜是通过非内吞形式，即直接转运方式，这是一种不消耗能量的转运方式.CPPs通过非温度、非能量、非受体依赖的方式进入细胞内，且在使用细胞内吞作用抑制剂的同时，穿膜转运未受到阻碍.但后续研究表明，CPPs通过内吞形式进入细胞膜.与直接转运不同，细胞内吞是一种耗能的转运方式，分为吞噬作用和胞饮作用.胞饮作用存在于所有类型的细胞中，常用的胞饮方式有巨胞饮、网格蛋白依赖途径和胆固醇依赖网格蛋白介导途径等.

目前，能够被大多数人接受的穿膜机理是CPPs以不同的内吞途径进入细胞膜[7-8].有研究认为细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在CPPs穿膜过程中起着重要的作用[9-10]，但作用机理仍不明确.在多数情况下，CPPs的穿膜机理与负载化合物有关，不同的负载物穿膜机理也会不同[11].

3　CPPs与药物的连接

在过去十几年中，随着更多CPPs被发现，其作为药物运输系统进入细胞越来越受到重视.在肿瘤疾病治疗过程中，通过共价键和非共价键的连接方式，将CPPs引入到药物分子结构，可起到很好的抗肿瘤效果.常用的共价连接键有酸酐、氨基酸、二硫键和硫酯键等，非共价键连接则通过静电相互作用或与特定碱基对形成氢键作用组合到一起.本文以应用较多的部分抗肿瘤药物为例.

3.1共价键连接

共价键连接是CPPs通过连接桥与药物分子结合，并在细胞内释放药物，起到抑制肿瘤细胞生长的作用.

3.1.1阿霉素与CPPs的连接

阿霉素(Doxorubicin，DOX)，是一种应用广泛的抗肿瘤药物，由于在肿瘤治疗过程中存在多药耐药性，限制了其在临床上的应用.DOX通过连接桥与CPPs连接在一起，能够顺利地进入肿瘤细胞，克服耐药性的缺陷，增强抗肿瘤效果.

脑瘤和中枢神经系统疾病由于血脑屏障的限制，阻止药物进入到作用靶点，降低了治疗效果.一些天然的多肽可以穿透血脑屏障而不破坏其完整性，Rousselle 等[12]将DOX 与 D-penetratin 和SynB1 通过连接桥组成共价偶联物，利用原位小鼠脑灌注方法来研究偶联物的穿透能力，可以增强DOX的脑吸收.之后又用相同的方法将DOX 与L-SynB1、L-SynB3和D-SynB3组成偶联物[13]，并使用单独放射性标记的DOX作为对照，由于存在耐药性，只有很少被大脑吸收，而偶联物可以明显提高DOX的脑吸收(提高大约30倍).研究表明，在多肽的介导下，可以增强药物通过血脑屏障的能力.

Liang等[14]将Tat引入到DOX结构中，通过连接桥合成了DOX-Tat偶联物，与游离的DOX相比，偶联物具有不同的细胞内分布方式和细胞杀死活性，且DOX-Tat可以很好地渗透到耐药性细胞内，对MCF-7/ADR耐药性肿瘤细胞，其IC50值比DOX的低8～10倍，能够有效杀死耐药性肿瘤细胞.

Mäeyer-Losic等[15]使用不同的连接桥将一系列的Vectocell多肽与DOX结合在一起，通过体外和体内活性研究，对于结肠癌和乳腺癌肿瘤模型，当DOX与DPV1047结合时，可以改善DOX的体内治疗指数.对于耐药性肿瘤细胞，偶联物可以明显增强DOX的抗肿瘤活性.

Aroui等[16]使用偶联剂琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯(SMCC)作为连接桥，将DOX与CPPs(Tat、penetratin和maurocalcine)组成偶联物，并采用药物敏感性肿瘤细胞MCF-7和耐药性肿瘤细胞MDA-MB-231分别进行细胞实验.3种多肽对2种肿瘤细胞均无抑制作用，只有浓度达10μmol/L时有微弱的细胞毒性.细胞定位实验表明，CPPs可以增强DOX的细胞穿透能力，MTT实验显示，只有对耐药性肿瘤细胞可以明显增强DOX的细胞活性，且可以延长DOX的作用时间.而对于药物敏感性肿瘤细胞反而不如单独使用DOX作用的效果好.接着他们又对DOX和DOX-CPPs诱导肿瘤细胞凋亡机制做了进一步研究[17-18].

后来，Aroui等[19]又通过化学共轭方法将DOX 与penetratin和Tat形成偶联物，并用多种肿瘤细胞进行细胞毒性试验、细胞内分布和吸收实验.结果表明，与游离的DOX相比，偶联物表现出不同的细胞致死活性和细胞内分布.细胞毒性试验表明，偶联物可以增强DOX对CHO细胞、HUVEC细胞和MDA-MB-231细胞的毒性，但对NG108.15和MCF-7肿瘤细胞的毒性有所降低.细胞吸收实验表明，DOX-CPPs偶联物在细胞中的积累量明显大于DOX，证实了penetratin和Tat可明显增强DOX在肿瘤细胞中吸收和减少药物挤压.

上述课题组分别研究了CPPs在药物敏感性肿瘤细胞和耐药性肿瘤细胞中对DOX的活性的影响，对于耐药性肿瘤细胞MDA-MB-231，CPPs-DOX偶联物可以明显增强DOX的抗肿瘤活性，细胞内定位实验观察到，DOX在细胞内的吸收明显提高，从而证实了CPPs可增强药物细胞穿透能力.

Nakase等[20]通过内体活性实验研究CPPs(八精氨酸(R8))的穿透能力，细胞观察实验显示，R8可在肿瘤组织中高度聚集，使用4 mg/kg R8-DOX偶联物处理的小鼠，可以有效地抑制肿瘤增殖，而用纯的DOX药物6 mg/kg处理的小鼠，未观察到体重有明显变化.

Shi等[21]为了研究ACPP-DOX偶联物对基质金属蛋白酶(MMPs)的敏感性，选用两组肿瘤细胞进行试验.流式细胞术和激光共焦显微镜研究表明，MMPs过度表达的肿瘤细胞对偶联物吸收较强，MMPs低表达的肿瘤细胞对偶联物吸收较少.抗增殖测试结果显示，ACPP具有很小的毒性，而ACPP-DOX可以明显地抑制肿瘤细胞增殖.实验表明，ACPP-DOX可以被MMP-2/9触发，对MMPs过度表达的肿瘤细胞具有较好的治疗效果.

Shirazi等[22]通过适当的连接器将DOX与环肽W(RW)4以及相应的线肽(RW)4组成偶联物，并用多肽和药物以物理方式混合作为对照.研究结果表明，环肽W(RW)4-DOX对多种肿瘤细胞表现出较好的抑制率，且比(RW)4-DOX具有更高的抗增殖活性.流式细胞术分析显示，W(RW)4-DOX在细胞内的吸收是单独DOX的3.6倍，细胞内水解研究发现在72 h内，有99%的W(RW)4-DOX在细胞内水解并且释放出DOX，数据分析显示，W(RW)4-DOX可以作为潜在的前药，改善DOX在细胞内的传递和停留时间.

Lelle等[23]合成了两种DOX与CPPs偶联物，两种CPPs的静电荷、二级结构和来源都不相同，选用一种新型小分子交联剂作为连接桥.MCF-7和HT-29肿瘤细胞的细胞吸收实验和毒性研究表明，CPPs可以显著增强DOX的细胞穿透性，而且偶联物可以被谷胱甘肽裂解将DOX传递到细胞核内，增强DOX的抗肿瘤活性.

Chen等[24]通过组织蛋白酶B降解的四肽连接器将DOX与Tat结合在一起，设计合成了3种偶联物，NTD、d-NTD和q-NTD，连接DOX的数量分别是1，2，4.细胞存活实验研究了药物在细胞的积累量和释放率分别对肿瘤细胞的作用效率，结果发现，q-NTD在细胞内的积累量最多，而NTD则表现出较低的细胞内积累浓度，但进一步发现，d-NTD在3者中具有最好的抗肿瘤活性.说明药物在细胞内的积累效率和药物的释放率都要考虑，才能得到更好的抗肿瘤效果.

由上述研究结果可知，研究较多的CPPs有Tat、penetratin、SynB和R8等，不同研究者选用的共价连接键也不相同.对于同一种CPPs，环状结构与线状结构相比具有更好的细胞穿透能力，但CPPs在增强药物抗肿瘤活性方面是不容置疑的，且随着进一步研究发现，对于负载药物的量需要寻找最优浓度，才能达到最好的抗肿瘤效果.

3.1.2甲氨蝶呤与CPPs的连接

甲氨蝶呤(Mäethotreate，MTX)是一种抑制细胞生长的抗肿瘤药物，通过抑制嘌呤核苷酸的合成，同时阻止DNA复制，进而抑制二氢叶酸还原酶来阻止肿瘤细胞增殖.由于自身耐药性问题限制了其应用，MTX通过连接桥与CPPs形成偶联物可以改善对肿瘤细胞的耐药性.

Lindgren等[25]将MTX与YTA2通过化学共轭方法组成偶联物，研究了偶联物MTX-YTA2对耐药性细胞MDA-MB-231的细胞毒性.实验选取的肿瘤细胞株缺少还原型叶酸载体的表达，这是MTX进入细胞的主要途径，故肿瘤细胞在传送MTX上是不完整的，也缺少对MTX的敏感性.细胞存活实验研究中，偶联物MTX-YTA2的EC50值是单独MTX的5倍.结果证明，MTX可以被YTA2成功地输送到肿瘤细胞内，而且能够克服MTX对肿瘤细胞的耐药性.

Mäe等[26]在体外实验选用耐药性肿瘤细胞MDA-MB-231，结果显示CPPs(YTA4)介导的MTX活性明显提高，而YTA4自身不具有细胞毒性，说明YTA4可以增强MTX的细胞穿透性.而MTX-YTA4与MTX-TA2相比，两者的EC50值分别为19.0，3.8μmol/L，说明YTA4的细胞穿透能力相对较小.体内活性测试用偶联物MTX-YTA4对小鼠进行处理，单独的MTX处理为对照实验.4周后，发现YTA4介导的偶联物与单纯MTX相比，抑制肿瘤细胞扩散效果未得到改善，说明CPPs介导小分子药物的体内实验有待进一步研究.

3.1.3紫杉醇与CPPs的连接

紫杉醇(Paclitaxel，Taxol)最先是从美国西海岸红豆杉的树皮中提取出来的一种二萜类化合物，具有促进微管蛋白聚合活性.对于普通肿瘤细胞，Taxol表现出很好的抗肿瘤效果，但是对于耐药性细胞株效果却很差，限制了其在临床上的应用.

Dubikovskaya等[27]通过二硫键将R8结合到Taxol，组成偶联物，能够在细胞内释放出Taxol.肿瘤细胞实验选用两种卵巢癌模型，对Taxol敏感的OVCA-429和对Taxol产生耐药性的OVCA-429T，将肿瘤细胞模型植入小鼠腹腔内，分别用偶联物R8-Taxol和游离的Taxol进行实验.结果显示，对于Taxol敏感的OVCA-429，R8-Taxol和Taxol具有相似的抗肿瘤活性.而对Taxol产生耐药性的OVCA-429T，R8-Taxol处理的小鼠与游离的Taxol处理的小鼠相比可以明显提高存活率，说明在R8介导下，可以克服Taxol的多药耐药性.

Eggimann等[28]通过将线肽CPPs重新设计改造成多枝状的拓扑结构，含有短的二肽分枝，得到了CPPs树枝状分子结构.通过共价键与Taxol连接在一起，研究表明，树枝状的CPPs与线状CPPs相比，具有更好的细胞穿透性、更低的细胞毒性和溶血性，还有更高的血清稳定性，可以明显增强Taxol的抗肿瘤活性.

3.1.4瘤可宁与CPPs的连接

瘤可宁(Chlorambucil，Cbl)是一种氮芥类烷化剂，通过与DNA烷基化和交联作用来抑制DNA的合成，进一步抑制肿瘤细胞增殖.但是一定剂量的Cbl在抑制肿瘤细胞增殖的过程中，也会对正常细胞产生作用.

为了增强Cbl对肿瘤细胞的选择性和特异性，Myrberg等[29]通过将Cbl与pVEC-PEGA组成偶联物，并进行细胞活性实验，结果显示，偶联物可以将单独Cbl的作用活性提高4倍.其中，环肽PEGA(cCPGPEGAGC)是一种肿瘤归巢肽，体内实验表明，PEGA积聚在肿瘤组织中，对肿瘤细胞具特定识别作用.p VEC是一种细胞穿透肽，可以将PEGA带入细胞膜内，被不同肿瘤细胞吸收.

同样地，Mäe等[30]将上述的肿瘤归巢肽PEGA用线肽CREKA替换，与嵌合肽PEGA-pVEC相比，CREKA-pVEC更容易合成，可以更好地将药物传送到细胞内.体外荧光标记实验证明，CREKA-pVEC可以进入细胞内，进一步通过化学偶联方法将嵌合肽与Cbl组成偶联物，进行细胞毒性实验，结果表明可以明显提高Cbl的活性.

Soler等[31]从抗菌肽分离出来一段CPPs (BP16)，通过对MCF-7、CAPAN-1肿瘤细胞和小鼠胚胎成纤维细胞373细胞株进行毒性实验，结果显示，在浓度达到200μmol/L时，BP16都无毒性.流式细胞术分析和共焦显微镜观察得到BP16通过一种网格蛋白依赖性的内吞作用进入细胞，并可以在细胞内有效积累.进一步，将BP16与Cbl结合在一起，组成偶联物，可以增强药物活性6～9倍，与传统的p VEC相比，可明显提高Cbl的抗肿瘤活性.

3.1.5喜树碱与CPPs的连接

喜树碱(Camptothecin，CPT)是一种天然存在的生物碱，体外活性研究表明，对多种肿瘤细胞株具有抗肿瘤活性，但是由于自身的水溶性差以及缺乏选择性，阻碍了其在临床上的应用.

Chel等[32]将聚轮烷(PR)与CPT通过易水解的连接桥结合在一起，再与细胞透肽LWMP组成复合物CPT-PR-LMWP.在肿瘤细胞内，通过共焦显微镜观察显示，复合物增强了CPT的细胞穿透性，而且可通过水解作用从复合物上分离下来，使得CPT溶解性增加了7倍，在体内持续时间超过7 d.

Zhang等[33]使用组氨酸替换赖氨酸，将CPPs (TK)改造成能够在酸性条件下被激活的TH，并通过二硫碳酸酯键连接桥与CPT组成偶联物.因为肿瘤细胞周围环境呈酸性，通过体外细胞实验，分别检测在p H7.4和6.0环境下，对肿瘤细胞的抑制作用.结果显示，TH-CPT在酸性条件下，可明显增强抑制肿瘤细胞生长，而TK-CPT在不同酸性条件下，相同浓度的偶联物对肿瘤细胞的抑制活性无改善，但两者都较游离的CPT具更好的细胞活性.

肿瘤细胞表面的蛋白质可以被一种大环寡肽捕获，从而可以有效地识别肿瘤细胞，大环寡肽含有抗蛋白酶的D型胱氨酸.Hirata等[34]通过将大环寡肽和多个CPPs连接在一起，再用在细胞内易断裂连接桥与CPT结合，设计合成了一系列复合物.细胞活性研究表明，CPPs可以明显增强CPT的细胞穿透性和选择性.

由上述结果可知，在选用共价键连接器的时候，应选用在细胞内经过代谢作用易水解的连接器，不仅可以有效地将治疗药物释放到靶点，抑制肿瘤细胞生长，而且可以延长药物在细胞内的停留时间，增强药物的生物利用度.

3.2非共价键连接

非共价键连接是通过分子间的相互作用，或静电作用将CPPs和药物分子组合在一起，并将药物带入到细胞内，然后释放出来产生效果.

Mandal等[35]使用荧光标记CPPs同手性环肽[W5R4K]和DOX的复合物，通过共焦显微镜观察到，复合物可以明显地穿透卵巢癌细胞(SK-OV-3)进入到细胞核内，等温滴定量热法(ITC)测定环肽和DOX的结合常数，结果显示，复合物是通过多步分子间相互作用结合到一起的，细胞穿透机理是内吞依赖型的穿透方式.

CADY-1是一种两亲性分子多肽，可以通过自组装形成复合物，具有细胞穿透能力，能够把小分子化合物包裹在里面运输到细胞内.Li等[36]将CADY-1与DOX按照最优的物质的量之比以自组装的形式形成稳定的复合物，可以延长DOX在血液中的停留时间，并将DOX运输到细胞内，增强DOX的治疗指数.动物实验中，CADY-1/DOX复合物与脂质体DOX或纯DOX相比具有更好的药物耐受性和抗肿瘤活性，研究表明，CADY-1可以作为一种潜在的药物输送系统.

4　结　语

CPPs具有穿透细胞膜的功能，可以负载外界物质传递到细胞内，包括蛋白质、多肽、RNA、脂质体及小分子化合物等，对于目前部分抗肿瘤药物存在的缺陷提出了有效的改善方法，通过共价键和非共价键与小分子抗肿瘤药物组成偶联物，可以改善药物分子的水溶性差、易产生多药耐药性、难以穿透细胞膜等缺陷，提高药物分子的治疗指数.虽然细胞穿透机理尚不明确，但是体外和体内活性研究证明了CPPs可以有效地增强抗肿瘤效果，为目前抗肿瘤药物的给药系统提供新的途径，未来会成为临床研究热点之一.

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(编辑吕丹)

Recent Advances on Cell Penetrating Peptides in Enhancing the Anticancer Effect

MA Zhonglin，KAI Zhenpeng，WU Fanhong
(School of Chemical and EnvironMental Engineering，Shanghai Institute of Technology，Shanghai 201418，China)

Cell penetrating peptides(CPPs)，a class of peptides with a remarkable capacity for Mäembrane transportation，can deliver a large variety of biological cargoes and induce the biological effects.SoMäe existing anticancer drugs due to their poor solubility，low efficacy，high toxicity and multi-drug resistance，thus affect the effects of cancer treatMent.The current research progresses of cell penetrating peptides enhancing the anticancer effect were reviewed.New ideas were put forward for seeking efficient delivery system of anticancer drugs.

cell penetrating peptides(CPPs)；endocytosis；drug delivery；conjugates； anticancer

R 914.5

A

1671-7333(2015)02-010305

10.3969/j.issn.16717333.2015.02.001

2014-11-06

国家自然科学基金资助项目(21472126)；上海市科委资助项目(12XD1404600)

马中林(1990-)，男，硕士生，主要研究方向为药物设计与合成.E-mail：mazhonglin@mail.sit.edu.cn

吴范宏(1968-)，男，教授，博士，主要研究方向为药物合成工艺.E-mail：wfh@sit.edu.cn