纤维素酶分子改造技术研究进展

柯 轶，王 娜，林俊涵

（福建生物工程职业技术学院，福建 福州 350000）

社会的发展离不开能源的供给，但是近年来全球能源匮乏，天然气、煤炭和石油等能源储备量逐年下降。Laherrère和Campbell两人根据目前石油开采情况和全球石油储备情况进行分析，预测从2010年开始，全球天然气、石油的开采量将下降，到2050年，全球石油供应量将从目前每年25亿桶，降低至每年5亿桶［1］。石油、煤炭等能源都是不可再生资源，所以寻找一种可再生的能源资源迫在眉睫。纤维素是地球上数量最多的可再生资源，约占总生物量的40%，是一种很好的可再生生物质能，目前人类每年所消耗的能源仅仅是这部分能源的1／10［2］。如果可以利用生物转化技术将纤维素转化成可利用的单糖，并通过生物发酵等后续加工将单糖转化为乙醇等绿色能源，不仅可以缓解当今社会的能源危机，还可以减少石油、煤炭等传统能源燃烧带来的环境污染。但是纤维素具有稳定的结晶结构，在常温下不易溶于水，也不易溶于一般的有机溶剂如乙醇、苯、丙酮等，而且其结晶结构十分紧密，又有其他生物聚合物镶嵌在一起，大大增加了其降解难度。

纤维素酶是能够将纤维素降解成单糖的一种复合酶，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β－D－葡萄糖苷酶。在降解纤维素方面，它具有特异性高、反应条件温和、绿色无污染等特点，是当今生物质能研究的热点。但是在工厂化生产中，纤维素酶也存在着不足之处，例如不耐高温、降解效率低、易受产物抑制等，这些不足制约了纤维素酶的进一步开发利用。分子改造为纤维素酶实现工厂化生产提供了可能。纤维素酶分子的改造是近年来学术界的研究热点，该技术的应用有效弥补了纤维素酶在工业生产上的不足，使纤维素酶在降解纤维素方面更完善。本文对近年来纤维素酶及其分子改造技术的研究进行了综述。

1 纤维素酶酶系组成及其作用机理

1.1 纤维素酶酶系组成

纤维素酶主要来自于细菌和真菌，属于糖苷水解酶类，是一类复合酶，是由多种能够水解纤维素中β－D－糖苷键的酶组合而成。根据水解功能的不同，可以将纤维素酶中的各种酶分成三大类：内切型β－葡聚糖酶（E.C 3.2.1.4）；外切型β－葡聚糖酶（E.C 3.2.1.91）；β－葡萄糖苷酶（E.C 3.2.1.21）。

内切 型β－葡聚糖酶（E.C 3.2.1.4）：也称EG，胞外酶型的分子量介于47～76KDa，胞内酶型的分子量介于23～118KDa［3］；主要作用于纤维素的非晶体区，水解β－1－4糖苷键，使得纤维素产生大量的非还原断，主要产物有纤维糊精、纤维二糖、纤维三糖等。

外切型 β－葡聚糖酶（E.C 3.2.1.91）：也叫CBH，分子量介于38～118KDa，是纤维素酶中重要的组成部分，主要作用于纤维素链中的非还原端，水解β－1－4糖苷键，每次水解都会从纤维素链上切下一个纤维二糖分子，主要的水解产物有纤维糊精和纤维二糖。

β－葡萄糖苷酶（E.C 3.2.1.21）：也称BG，胞内酶型分子量介于90～100KDa，胞外酶型分子量介于47～76KDa，主要作用是将短链的纤维寡糖或者纤维二糖水解成葡萄糖。

1.2 作用机理

目前有三种纤维素酶水解机理被学术界普遍接受：碎片理论、原初反应假说和协同理论。其中协同理论是多数研究人员所接受的。协同理论认为，纤维素酶在降解纤维素的过程中，内切酶、外切酶和葡萄糖苷酶之间相互协作，共同完成纤维素的降解［4］。但是这一观点也存在的两种争议：一是认为在降解过程，先由EG从纤维素分子内部随机水解β－1－4糖苷键，产生非还原端，之后CBH从非还原端水解产生纤维二糖，最后由BG水解纤维二糖产生葡萄糖；二是认为在降解过程中，先是由CBH水解不溶性纤维素，产生可溶性的纤维二糖和纤维糊精，之后由EG水解β－1－4糖苷键产生纤维二糖，最后由BG水解纤维二糖产生葡萄糖。两种争议主要是内切酶和外切酶作用的先后顺序。

2 纤维素酶分子改造技术

纤维素酶分子改造技术是从DNA层面上使得纤维素酶编码区或者上下游调控区内的碱基发生突变，从而改变纤维素酶空间结构，提高纤维素酶性能或者提高纤维素酶产量。

2.1 提高纤维素酶性能的分子改造技术

提高酶性能的分子改造技术主要是改造酶催化结构和结合域的空间结构或者是氨基酸之间的化学键，以更好地催化纤维素的水解。常用于提高纤维素酶性能的分子改造技术主要有定点突变技术、易错PCR、DNA改组技术。

2.1.1 定点突变 定点突变技术是Michael Smith发明的，他也因此获得了1993的诺贝尔奖化学奖。在定点突变发明之前，突变株的产生是通过自然界或者化学诱变等方法使基因发生变化，但是这些突变方法通常时间漫长或者不定向突变。而定点突变技术则可以让突变变得可控，是研究蛋白质结构与功能之间关系的有效手段，是探索启动子调节位点的有力工具，是优化、改造基因的便捷方案。定点突变技术的基本原理是设计一对包含有目标突变的引物，这个突变可以使单个碱基的改变，也可以使多个碱基的改变，缺失或者增加。利用这对含有目标突变的引物去扩增目的基因，这样拷贝后的基因就包含了所需的突变位点。之后再利用载体将目的片段导入宿主细胞进行克隆，最后通过DNA测序技术确保目的片段已导入宿主细胞。

定点突变技术通常与生物信息学结合使用，首先对待改造纤维素酶进行同源分析，对其分子结构与功能的关系进行研究，包括影响pH、热稳定性、底物结合区域等结构，之后在模拟软件中进行突变，预测突变体的结构和新的功能，根据所掌握的信息，在相应的位点设计含有目标突变的引物进行突变。方芳等［5］利用定点突变技术对糖苷水解酶家族中EGV（endoglucanase V）的耐热性进行改造，在进行同源建模和序列比对后，将第49位的脯氨酸删除，之后将突变体导入毕氏酵母进行研究分析，结果发现在70℃环境下处理2h，突变酶49P（del）剩余酶活性为72.8%，而EGV剩余酶活性只剩51.2%，热稳定性比EGV 提高了21.6%，其他酶性质与EGV基本相似，这说明定点突变技术有效地提高了EGV的热稳定性；唐自钟等［6］人利用定点突变技术对高酶活F－10突变株内切葡聚糖酶基因进行定点突变，将位于第91位的赖氨酸突变为谷氨酸（K91E），第369位的赖氨酸突变成精氨酸（K369R），构建了含有K91E、K369R及K91E／K369R等3个质粒的工程菌，试验结果表明3种工程菌所产的内切葡聚糖酶在热稳定上都有所提高，在70℃下处理1h，K91E剩余酶活力为36%，K369R剩余酶活力为30%，K91E／K369R剩余酶活力为41%，相比而言，原始酶剩余酶活力仅为12%。在酶的比活力比较中，K31E、K369R、K31E／K369R的比活力分别为202U／mg、162.8U／mg、77.9U／mg，分别比原始酶提高了3倍、2.4倍、1.2倍。张洪喜［7］对纤维素酶cel 18－7进行体外定点突变，将第212位上的Asn突变成Asp和His，将第140位上的His突变成Gln，结果发现cel18－7N212D的最适pH值由原先的6.0～6.5偏移到5.5，在碱性环境中酶活降低，cel18－7N212H最适pH偏移到6.5～7.0，在碱性环境中酶活提高，cel18－7H140Q最适pH偏移到了5.0，对酸碱的耐受性提高了。

2.1.2 易错PCR 易错PCR是体外定向进化常用技术之一，原理是在目标基因进行复制扩增过程中，通过改变反应体系、加入锰离子，提高镁离子浓度等手段，降低复制过程的保真性，随机引入突变位点，之后通过筛选获得有益突变体。易错PCR的关键技术在于如何选择合适的突变频率，如果突变频率过高，将导致绝大部分的突变为有害突变，不利于后期有益突变体的筛选。易错PCR与定点突变技术相比较，易错PCR不需要预先知道目的基因的序列（引物结合部分除外），这有利于研究人员对基因序列未知蛋白的研究。

目前，利用易错PCR定向改造纤维素酶的报道很多。唐自钟等［8］利用易错PCR技术对来自枯草芽孢杆菌C－36的内切葡聚糖酶基因进行定向突变，并通过筛选获得了一株有益突变体F－10；对于F－10的研究表明其所分泌的内切葡聚糖酶的活性比亲本酶提高了4.2倍，测序结果发现易错PCR结果导致目标基因序列中5个碱基发生改变，导致2个氨基酸发生突变，分别为D212V、T307S。姚友旭等［9］通过易错PCR技术对枯草芽孢杆菌C－36内切葡聚糖酶基因进行定向改造，最终筛选到两株最佳突变株b－15和b－28；结果表明，b－15分泌的内切葡聚糖酶的活性比亲本酶提高了2.1倍，b－28的酶活性比亲本酶提高了3.6倍；测序结果表明，突变体b－15目的基因共有6个碱基发生改变，导致4个氨基酸突变，分别为N134K、Q140L、N403S与Q466L；突变体b－28的目的基因上有一个碱基发生变化，导致398位的赖氨酸突变为精氨酸。张扬［10］采用易错PCR对嗜热子囊菌的egⅠ基因进行定向突变，最终获得两株酶活提高的菌株NT0252和NT0253，测序结果发现NT0252中3个氨基酸发生突变：F52E、D91N、W170H，NT0253中有3个氨基酸发生突变：A14G、H198M、S224C；这些突变导致所产的纤维素酶酶活分别提高了2.19倍和1.88倍，最适温度分别提高了10℃和5℃，最适pH值由原先的4.0分别变为5.0和6.0。

2.1.3 DNA 改组 DNA 改组技术（DNA shuffling），又称有性PCR，是由stemmer在1994年发明的。其原理及步骤如下：（1）目的基因的获得。目的基因可以是单一的基因，或者是某个基因家族，目的基因之间必须具有一定的同源性。（2）目的基因的随机片段化。待改组基因可以通过DNase I或者超声波等技术进行随机切割成一定大小的片段。片段大小与突变频率、重组频率密切相关，片段的大小可以通过控制酶量和反应时间来控制。（3）无引物扩增。即不添加引物进行PCR。在这个过程中，不同片段互为引物互为模板，由于配对的不精确性，就会在扩增中引物突变（缺失、插入、点突变、颠倒、整合等）及重组。（4）有引物PCR。在这一过程中，加入特定的引物对目标基因进行扩增，从而获得全长的目标片段。（5）筛选。将扩增到的目的片段导入宿主进行表达，通过筛选获得目的功能有所提高的突变株，之后以这些突变株作为下一次DNA改组的模板，重复1～5次重组，知道获得性状改良明显的突变体。

DNA改组技术与其他突变技术相比，其具有诸多优势：（1）可以实现同源序列间大片段的交换；（2）高通量突变、筛选的技术；（3）可以进行反复筛选；（4）可以实现目的蛋白的多种特性的共进化；（5）提高了良性突变的概率。DNA改组作为一种体外定向进化的技术，也常常被用于改造纤维素酶分子。姜大磊［11］提取绿色木霉的内切葡聚糖酶Ⅰ基因，利用改组技术对内切葡聚糖酶Ⅰ基因进行突变和改造，构建了重组突变体库，并通过选择性培养基（羧甲基纤维素钠培养基）筛选到了4株内切葡聚糖酶活性较高的突变体S1、S2、S3、S4；通过酶活检测发现S1、S2、S3、S4所产内切葡聚糖酶酶活比亲本酶提高了5.75、4.78、3.19、361倍。白玉［12］以嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Ⅰ基因为改造对象，利用DNA改组技术对野生型egⅠ基因进行突变，最终通过筛选获得一株酶活性较高的菌株BY2，其酶活为23.75U／mL，为原始菌株酶活提高了10倍。林凌［13］从450株海洋菌和陆地样品中克隆到能够表达出具有较高水解活性的内切葡聚糖酶基因cel5A；之后通过DNA shuffling技术对cel5A进行突变，通过刚果红染色法筛选到3株高活性菌株：M44－11、S75、S78，其所产内切葡聚糖酶水解羧甲基纤维素钠的活性是原始菌株的2.03、2.54、2.68倍，其中 M44－11所产的内切葡聚糖酶在热稳定性和耐酸碱性都有所提高。

2.2 提高纤维素酶产量的分子改造技术

提高酶量的分子改造技术并不针对酶的空间结构和氨基酸之间的化学键，而是通过调节转录因子、启动子、密码子等手段来影响酶的表达量。

2.2.1 启动子 启动子的本质是一段能够与RNA聚合酶特异性结合的DNA序列，它可以通过与转录因子结合控制基因表达的程度和起始时间。而强启动子则是指与RAN聚合酶有着很高亲和力的启动子，它能够知道宿主转录出大量的mRNA。强启动子常常被用于提高目标蛋白的研究中，将强启动子与所需的目标蛋白基因整合导入宿主细胞，让宿主细胞表达大量的目标蛋白。目前较为常用的强启动子包括来自大肠杆菌的乳糖操纵子lacP、色氨酸操纵子trpP、多角体蛋白基因启动子、sv40启动子、T7启动子等。

关于利用强启动子提高纤维素酶产量的报道很多。Ma等［14］为了提高里氏木霉的纤维素产量，将斜卧青霉的β－葡萄糖苷酶I和T.reesei的cbh1的启动子构成的载体导入到里氏木霉中进行表达，通过筛选发现2株转化菌株产的β－葡萄糖苷酶I的酶活比原始菌株提高了6～8倍。陈科等［15］为了提高celY基因在原核细胞中的表达量，将celY分别与T7启动子、脂蛋白启动子相连接，导入到表达宿主细胞中，结果celY－T7启动子、celY－脂蛋白启动子两种表达宿主都在不同程度上提高了纤维素酶的表达量。

2.2.2 转录因子 转录因子是一类蛋白分子，这类蛋白分子能够参与调控基因的转录，在一定程度上影响基因的表达量。关于转录因子的调控纤维素酶基因表达的报道很多。薛番艳等［16］在黑腐病菌中发现一个调控纤维素酶合成的转录调控因子XC－2736（HpaR1），研究发现如果突变体中缺失转录因子HpaR1，则突变体几乎无法检测到胞外纤维素酶，之后将HpaR1通过功能反式互补到突变体中，结果发现突变体恢复了纤维素酶的活性，这说明HpaR1可以调控纤维素酶的表达。张纪伟［17］在瑞氏木霉中发现了调控纤维素酶表达的转录因子TrRas2，研究人员当将TrRas2用分子手段敲除后，发现瑞氏木霉表达纤维素酶的能力明显降低，而当研究人员持续激活转录因子TrRas2时，瑞氏木霉中主要的纤维素基因cbh1和cbh2的表达量比原始菌株分别提高了73%和128%。

2.2.3 其他方法 Teng等［18］通过优化纤维素酶的密码子组成，使得β－1，3－1，4葡聚糖酶在表达宿主中的表达量提高了10倍。Wang等［19］利用RNA干扰技术将阻遏纤维素酶和木聚糖酶相关代谢的基因沉默，结果发现RNA干扰后的菌株所产外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶活比原始菌株提高了0.8倍、1.4倍和0.8倍。周广麒等［20］人构建了一株去泛素化酶基因creB缺失的斜卧青霉突变株ΔcreB，结果发现ΔcreB表达的外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶的酶活比原始菌株分别提高了2.04倍、1.71倍、2.06倍，说明creB基因可能参与了纤维素酶表达的过程。

3 结语

纤维素酶作为一种可降解纤维素的高分子复合酶，具有特异性高、反应条件温和、绿色无污染等降解特点。随着纤维素酶在各行各业中的广泛应用，生产者对于纤维素酶的要求也越来越高，而当前已知的自然界纤维素酶已经不能够满足工业生产的要求，寻求高产高活性的突变株迫在眉睫。传统的诱变技术存在周期长，突变率低等缺点，而分子改造技术的发展为研究人员提供了一条全新的思路。近年来，研究人员利用分子改造技术在改善纤维素酶学性能和提高纤维素酶产量方面取得了很大的进步。虽然离工业生产要求还有一定的距离，但是相信随着分子生物学、生物化学、生物信息学等交叉学科的发展，以及人们对纤维素酶分子改造研究的深入，纤维素酶必然会达到工业生产要求，必将在环境保护、能源开发等领域发挥越来越大的作用。

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