木霉葡聚糖酶及其编码基因研究进展

曲晓华，谭 飞，马 杰

（1.威海市园林管理局，山东 威海 264200；2.山东高速路桥养护有限公司，山东 济南 250014；3.威海市环境保护局，山东 威海 264200）

木霉属真菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目的粘孢菌类。葡聚糖酶广泛存在于动植物、藻类、细菌和真菌体内，是木霉防治真菌性病害的主要机制之一，在生物防治过程中有降解真菌细胞壁的活性因而被经常研究。

1 葡聚糖酶的组成、来源及酶学性质

葡聚糖是由D－葡萄糖以α和（或）β两种构象形式连接构成的一类均聚物。有些葡聚糖分子是由葡萄糖残基以简单的线性形式连接而成，而另外一些则是由线性和带支链等复杂结构的形式存在［1－2］。

α－葡聚糖和β－葡聚糖广泛存在于自然界中。葡聚糖酶降解的多聚体在自然界中以纤维素和半纤维素大量存在，作为胞内多糖储备形式的糖原是一种α－1，4葡聚糖，它广泛存在于除了卵菌以外的真菌中。在卵菌中，胞内多糖是以β－1，3－葡聚糖储备的。另外，葡聚糖还参与真菌细胞壁的组成和胞外多糖的形成［3－4］。葡聚糖裂解酶广泛存在于高等植物、细菌、真菌和依靠它们生存的各种各样的寄主中。在高等植物中，葡聚糖裂解酶被认为是植物抵御病原真菌的防御系统之一［5］。目前已报道的β－葡聚糖酶的不同功能包括：细胞壁中葡聚糖的转移和饥饿状态下储存糖原；降解植物病原体的胼胝质［6］；腐生生物的营养；真菌寄生物的致病机理和营养等［7］。参与细胞内或胞壁骨架处器官形成的葡聚糖酶通常具有高Km值、并且表现出组成型形成或发育调控的特点。代谢水解酶更倾向于分泌到胞外，具有较低的Km值，它们一般受到营养参数的调控，通常不会在菌丝中累积［8－9］。

2 葡聚糖酶的纯化和性质

2.1 β－葡聚糖酶的纯化和酶学性质

大部分人采用色谱分析技术来提纯β－葡聚糖酶。Dubordieu等［10－11］在1985年从哈茨木霉的商品酶制剂中分离到2个外切β－1，3－葡聚糖酶、1个内切β－1，6－葡聚糖酶和1个β－葡聚糖酶单体。这两个外切β－1，3－葡聚糖酶中，一个酶的活性中心主要是由分子量大小为40kDa的蛋白构成的，此酶能降解灰霉病菌的β－1，3葡聚糖和β－1，6葡聚糖。β葡聚糖酶是由两个外切β－1，3－葡聚糖酶和一个内切β－1，3－葡聚糖酶组成的，它们的等电点pI分别为5.25、4.95和4.20。Bielecki等［12］从钩状木霉的另一个商品化制剂（名叫“Onozuka”）中分离纯化出2个β－1，3－葡聚糖酶：一个是酸性但没有裂解细胞壁活性的水解海带多糖（β－1，3葡聚糖）的酶，另一个对酿酒酵母有细胞壁裂解活性。Devries等［13］1973年从一株寄生在真菌中的钩状木霉里分离纯化出一种外切β－1，3－葡聚糖酶。Tangarone等［14］（1989年）在含有D－葡萄糖的培养基上培养长枝木霉，得到了一种昆布多糖酶，该酶仅仅催化β－1，3糖苷键的水解，其最适pH和温度分别为4.8和55℃，分子量为70kDa，HgCl2、MnCl2、KMnO4和N－溴代琥珀酰亚胺可显著抑制酶的活性。

近年来研究最多的是哈茨木霉CECT2413在寄生其他真菌过程中产生的β－葡聚糖酶。大部分研究都是采用等电法从哈茨木霉中分离出1种碱性同工酶和至少3种酸性同工酶。通常说的β－1，3－葡聚糖酶BGN13.1是以石耳多糖为介质采用吸附法纯化到的纯物质。BGN13.1的分子量是78kDa且不能被糖基化。这种酶在以酿酒酵母细胞壁和海带多糖为底物时表现出最大的酶活性（对海带多糖的Km值是3.3mg／mL）。这个酶属于内切β－1，3－葡聚糖酶。BGN13.1是木霉特有的酶，因为免疫学反应表明：这个酶的抗血清与从真菌和植物中提取的β葡聚糖酶没有发生交叉反应。同样的这个酶与从哈茨木酶中提取的β－1，3－葡聚糖酶也不发生抗血清反应。哈茨木霉CECT2413至少产生2种的内切β－1，6－葡聚糖酶，纯化后发现分子量大小为51kDa和43kDa。这个43kDa的β－1，6－葡聚糖酶具有β－1，6连接，有内切活性没有糖苷键的链接［15］。将一些木霉（绿色木霉、长枝木霉、瑞氏木霉、康宁木霉、绿木霉）的培养物采用Western杂交进行检测，杂交结果表明这些木霉在相同条件下都产生BGN16.2。

2.2 α－葡聚糖酶的纯化和酶学性质

大部分的真菌菌丝细胞壁都含有一种碱溶性的α－1，3－葡聚糖，这对于细胞壁的成分和骨架构成的稳定性很重要。所谓碱溶性葡聚糖的成分较复杂，可以是近似纯的由α－糖苷键连接的多糖，也可以是由α－1，4糖苷键有规则地交替连接而成的聚合物。有报道在裂褶菌细胞壁上生长的绿色木霉菌株BS754.33产生的一个内切α－1，3－葡聚糖酶的纯化，这个酶是在低pH值、低离子强度下用CM－纤维素柱层析纯化得到的［13］。水解来自黑曲霉的拟黑曲多糖（Pseudonigeran，一种α－1，3葡聚糖）时仅仅释放出葡萄糖；但没有对这个酶水解黑曲霉多糖（Nigeran，为α－1，3－葡聚糖和α－1，4－葡聚糖的混合物）及水解淀粉活性的检测。Tsunoda等［16］描述了从来自绿色木霉的商品化纤维素酶制剂中纯化出了一个外切α－1，3－葡聚糖酶，这个外切α－1，3－葡聚糖酶的分子量为47kDa，最适pH值为4.5，Km值为7.1。李氏木霉在拟黑曲多糖培养基上至少能够产生一种分子量为47kDa的胞外内切α－1，3－葡聚糖酶，该酶的 Km值为10－2mol／L，对于一种与碳营养相关的酶来说，这个Km值就显得非常高了［17］，葡萄糖能抑制这个内切α－1，3－葡聚糖酶的形成。

1993年，Quivey等［18］也报道了从哈茨木霉菌株OMZ779里分离到一个大小为15kDa的内切α－1，3－葡聚糖酶。2001年，Ait－Lahsen研究了哈茨木霉菌菌株CECT2413的α－1，3－葡聚糖酶，发现该菌株在以多糖、真菌细胞壁或者蒸汽灭菌的菌丝为碳源时，可以分泌α－1，3－葡聚糖酶，其中的一个酶即AGN1311被分离纯化为单体酶，等电点偏碱性，该酶为外切的α－1，3－葡聚糖酶，可以裂解植物病原真菌的细胞壁从而抑制病原菌生长，Northern和Western分析表明，该酶可被模拟的拮抗条件所诱导产生。

3 葡聚糖酶编码基因、合成调控和功能

3.1 β－葡聚糖酶的编码基因

从哈茨木霉CECT2413中克隆到2个葡聚糖酶基因；一个是内切β－1，3－葡聚糖酶编码基因，基因编码的蛋白质大小为78kDa；另一个是内切β－1，6葡聚糖酶编码基因，基因编码的蛋白质大小为43kDa［19］。哈茨木霉基因所编码的成熟酶蛋白由728个氨基酸组成，该蛋白序列很可能是被一个Kex2加工肽酶所切割，然后终止于KR［20］。来源于细菌、酵母、丝状真菌和植物的bgn13.1线性序列的保守区域不同于其他来源的bgn13.1［21］。从一些文献中也可以看出由bgn13.1形成的外群体和其他的β－葡聚糖酶编码基因［22］或β－1，6葡聚糖酶编码基因［12］在亲缘关系上比较远。但是由bgn13.1形成的外群体和木霉纤维素酶的亲缘关系比较近。

哈茨木霉CECT2413的胰蛋白酶纯化后，根据其氨基酸序列设计兼并引物克隆了β－1，6－葡聚糖酶的编码基因［23］，与白色念珠菌来源的外切β－1，3－葡聚糖酶也有部分同源性。Rachel等［24］人研究了T.harzianum菌株 T－Y的β－1，3－葡聚糖酶分子生物学特性，并得到了它的基因序列。Su等［25］克隆了T.vriens的bgn1和bgn2基因，提取了该菌株的mRNA，构建了cDNA文库，以扩增得到的2条基因片段为探针，钓取了β－1，3－葡聚糖酶的全基因序列。高雯［26］等在哈茨木霉LTR－2中克隆出了内切β－1，3－葡聚糖酶基因glu，该序列已经提交GenBank，登录号为EF176582。

3.2 β－葡聚糖酶的合成调控和功能

和其他的一些丝状真菌一样，木霉和粘帚霉［27］也是通过底物诱导和代谢产物阻遏来调控β－葡聚糖酶的产生。像β－1，3葡聚糖这样的大分子是如何诱导酶的产生、催化自身分解的，答案仍然未知。通过与纤维素酶系统的类比，认为生物化学与分子生物学途径与一种模型相一致，在这种模型中，附着在分生孢子上的外切葡聚糖酶首先攻击了β－1，3葡聚糖分子［28］。释放出的二糖被菌丝体吸收，促进葡聚糖酶进一步的生物合成。生长在不同碳源中的绿木霉或生长在寄主细胞壁中的粘绿木霉，它们的培养基上清液中都有β葡聚糖酶活性、几丁质酶活性、脂肪酶活性和蛋白酶活性。几丁质也能诱导长枝木霉和玉米圆斑病产生β－1，3－葡聚糖酶［29］。

在自然情况下几丁质酶和葡聚糖酶的底物大多数情况下同时存在（真菌细胞壁），因此木霉的几丁质酶和葡聚糖酶一般被同时诱导产生，而仅仅为单一底物所诱导的情况并不多见［30］。酶对底物的相对活性是多种多样的，但是木霉β－葡聚糖酶的最高活性出现在其以寄主细胞壁作为基质生长的时候。用培养了8天以后的样品做SDS－PAGE电泳分析，结果表明胞外酶蛋白的出现明显受底物诱导和产物阻遏机制的影响，蛋白的失活、降解和所检测到的酶活性都是在不同的作用时间诱导的结果［31］。在另外一些真菌中，酶的失活是新蛋白合成、蛋白被部分酶解和糖组分消除造成的结果［32］。有人认为，不同真菌的细胞壁对水解酶的选择性诱导和木霉的重复寄生能力相关［33］。然而Ridout等［34］发现，木霉在以离体细胞壁为基质生长时产生的水解酶蛋白谱，不同于它直接拮抗植物病原真菌时产生的水解酶蛋白谱。

一些重要的β－葡聚糖酶被研究的很详细。Dela Cruz等发现哈茨木霉CECT2413在不同的碳源培养基上被几丁质、黑曲霉多糖（α－1，3和α－1，4葡聚糖）、石耳多糖（β－1，6葡聚糖）、真菌细胞壁、葡萄糖胁迫等条件诱导以后能产生外切β－1，3－葡聚糖酶和外切β－1，6－葡聚糖酶。但酶的产生被葡萄糖所抑制。无论是干扰RNA合成还是干扰蛋白质合成的化合物，都能够抑制对酶的诱导，表明在酶的合成过程中存在翻译前的调控机制，这种调控机制在很多其他菌株中（长枝木霉、绿色木霉、康宁木霉、李氏木霉和粘绿木霉）也观察到了相似的情形。在大多数情况下，当有2%葡萄糖存在的条件下一般都能观察到β－葡聚糖酶的基底活性。然而，当不同的β－葡聚糖酶同工酶被单独研究的时候就发现了一种不同的调控模式［27］。在几丁质、海带多糖、石耳多糖存在的条件下检测到4个同工酶，但在真菌细胞壁为基质生长时，只有基础性的内切β－1，3葡聚糖酶可以合成。BGN13.1的转录则不为葡萄糖所抑制，它的产物是基础性的内切β－1，3葡聚糖酶，在有2%葡萄糖存在的条件下生长，能检测到它的BGN13.1活性。当在真菌细胞壁中生长时，虽然这个内切β－1，3葡聚糖酶单独存在时不能在含有真菌细胞壁的培养基上产生透明水解圈，但是与其他水解酶配合，能够抑制植物病原菌。因为这个内切β－1，3葡聚糖酶的特异性诱导和裂解活性，被认为是木霉对其他真菌的拮抗酶，当然该酶在木霉的腐生生活中的意义也没有被忽略［35］。

哈茨木霉CECT2413的内切β－1，6－葡聚糖酶编码基因（bgn16.2）的表达也被葡萄糖所抑制，而为细胞壁中的聚合物所诱导，这个基因的cDNA是从80000个克隆中获得的唯一一个拷贝，其mRNA水平也很低，说明该基因的表达很微弱。将木霉放在酵母细胞壁培养基中培养，可以产生内切β－1，6－葡聚糖II，并产生透明的水解圈，酶的浓度较高时与其他水解酶协同作用，可以抑制其他真菌的生长，例如当浓度为25mg／mL时，抑制率为70%～80%［27］。真菌的β－葡聚糖酶有各种不同的作用，包括营养和抑真菌作用。哈茨木霉P1的78kDa大小的β－1，3－葡聚糖酶有抑真菌活性。它能与内切几丁质酶和几丁质－β－1，4壳聚糖酶（chitin－β－1，4－chitobiase）阻止灰霉病菌的孢子萌发和芽管伸长，当总蛋白质浓度为10～20μg／mL时能彻底的抑制病原菌的孢子萌发和芽管的伸长。

β－葡聚糖是木霉和粘帚霉细胞壁的重要组分之一，因此也容易受到葡聚糖裂解酶的作用［34］，但它们的细胞壁是如何避免自身产生的裂解酶之分解作用，这个问题仍不完全清楚。有一种解释认为没有活性的酶原蛋白从内部转运到外面，从而避开自身的细胞壁被裂解［36］。也探讨了其他的可能性，即细胞壁组分中含有抑制裂解酶活性的物质。Goldman等［37］从哈茨木霉重复寄生作用诱导产生的cDNA文库中筛选得到3个编码基因，编码的蛋白质分子量大小分别为69kDa，37kDa和15.6 kDa，其中分子量为15.6kDa的蛋白中含有一种基序，这种基序发现于富含丝氨酸和丙氨酸的结构蛋白中，能够抑制酶的水解作用［38］。另外，黑色素的可保护细胞壁免受裂解酶的水解。

一些β－葡聚糖酶和真菌的自溶有关系，但是这些酶在生理过程中的作用还没有完全弄清楚，例如：在细胞壁组分更新中的作用、在缺乏营养条件下细胞生存中的作用、与干扰细胞壁合成的杀菌剂之相互作用以及相关的一些现象之间的相互作用等方面。一些丝状真菌在碳源受限的条件下形态会发生改变，同时一些裂解酶活性会显著增加，其中β－葡聚糖酶的作用被认为是从贮存的β－葡聚糖为细胞提供能量。β－1，－3葡聚糖酶和β－1，6－葡聚糖酶参与老龄菌丝的自溶，而在菌丝的正常生长过程中通过影响结构性葡聚糖而帮助菌丝的伸长［39－40］。

4 展望

目前农业生产上的病害防治主要还是依靠化学农药，而长期大量化学农药的使用已经对人和环境及周边生物造成了很大的危害，因此近年来人们也越来越重视植物病害的生物防治。利用生物技术防治植物病害近年来发展迅速，木霉的葡聚糖酶能降解病原菌细胞壁中的葡聚糖，进而使病原菌的细胞破裂，病原菌的生长受到抑制，不能进一步的侵染和危害农作物。因此研究木霉葡聚糖酶及其编码基因对于防治农作物的病害的具有非常重要的价值，利用其编码基因构建转基因植物和微生物是防治农作物病害的有效途径。随着分子生物学技术的日益完善和成熟，人们越来越关注木霉葡聚糖酶及其编码基因的研究。随着研究的深入，未来利用木霉葡聚糖酶编码基因创制出具有市场竞争力的生物防治菌或者转基因植物，将具有可观的应用前景和巨大的市场潜力。

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