量子点的单分子生物成像

杨丹丹，罗　雪，王润芳，任小苗，马　迪，张紫薇(综述)，王　艳(审校)

(哈尔滨医科大学附属第一医院妇科一病房，哈尔滨150001)



量子点的单分子生物成像

杨丹丹△，罗雪△，王润芳△，任小苗△，马迪△，张紫薇△(综述)，王艳※(审校)

(哈尔滨医科大学附属第一医院妇科一病房，哈尔滨150001)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.038

量子点是直径在纳米范围(直径通常为2～10 nm)内的荧光半导体，其最新研究使量子点或量子点纳米晶体在生物分子及细胞成像上的应用成为可能。尽管量子点具有高度疏水性、毒性及与生物分子不相容性，但其独特的性能价值超过目前已知的有机染料和荧光蛋白：宽的激发光谱、可调和窄的发射谱及抗漂白能力。生物分子和细胞成像的第一个步骤就是功能化两亲配体的疏水表面。虽然功能化的两亲配体的大小大于原来的非涂布状态(2.0～9.5 nm)，但这些涂层的量子点基本上对细胞是无毒的，且其治疗上的应用已有报道[1]。该文简要回顾量子点作为荧光探针标记细胞、量子点的DNA诊断及单个生物分子探测的生物学应用，并讨论其实现单分子分析的前景。

1量子点的属性

量子点是直径为几纳米的单晶体材料，一般由不同类型的半导体材料合成，如硒化镉、磷化铟、碲化镉及砷化铟等。不同成分、不同尺寸的量子点提供不同的体积带隙能量并发射出特定波长的光，有代表性的是直径为2.0～9.5 nm的量子点发射400～1350 nm波长的光[2-3]。目前已允许通过控制合成条件来精确控制量子点的大小，这些合成的量子点的核心和核心-壳由于其疏水表面，因此只溶于非极性有机溶剂。

应用量子点作为生物成像的新型荧光探针，其生物相容性是最重要的挑战。在过去的几年中，应用了各种策略使量子点溶解在水溶液的缓冲区。硫醇(-SH)包含的分子常用来固定量子点表面的功能基团群[4-5]，亲水末端，如羧基(-COOH)使量子点变为水溶性[6]，低聚的膦[7]、树状分子[8]以及肽分子[9]等可以选择性改变量子点表面性质。与这些共价修饰方法相反，可采用两亲性聚合物涂层或包裹，如二嵌段[10]或三嵌段共聚物[11]、磷脂胶束[12]和多糖[13]。量子点在水中的溶解性和稳定性达到满意后，下一需求则将面向生物分子探针和活细胞，包含某种识别分子功能化量子点表面(如DNA寡核苷酸、RNA、肽、抗体等)。

许多方法可使生物分子与量子点共轭，如非特异性吸附量子点表面的简单水溶性小分子物(寡核苷酸[14-15]以及各种血清白蛋白[16]等)。这些非特异性吸附可以很容易地产生生物分子共轭物，但其表面状态也易被环境影响，如离子强度、pH值以及温度等。带负电荷的量子点可与带正电域的蛋白融合共轭[6]，这为胺基修饰的量子点与羧基修饰的生物分子特异性及稳定性吸附提供可能[2,4,8,17-20]，其中最常用的修饰是链霉亲和素涂层的量子点结合生物素化的寡核苷酸[12,14-15,20]、蛋白质[21]以及抗体[4,10,22-24]等。这些功能流程可重复，使量子点成为多能荧光探针。虽然通过功能层的形成可使量子点尺寸变大，但没有证据表明，共轭的生物分子的生物学功能被量子点干扰。因此，量子点也能作为有机染料。

2量子点作为探针在细胞生物学中的应用

量子点在细胞生物学中最为成功的应用是用作免疫荧光标记细胞和组织。研究人员基于量子点作为荧光探针已经进行了各种研究，如膜蛋白质[10,25-28]、微管[10]、肌动蛋白[2,10]及核抗原的膜染色[10]。由于量子点的信号本质上比有机染料强，而且能表现出较长时间的光稳定性和耐光漂白性，使量子点成为理想的探针。量子点所具有的一些光物理性质也使其具有局限性，其中之一是量子点在发光状态与非发光状态间的转变所引起的闪烁。量子点这种不连续的荧光限制了其应用，特别是在单分子范围内的应用。然而，在某些情况下，这种不连续发射有助于从人工免疫细胞化学实验中区分量子点信号。最近，Hohng和Ha[29]的研究表明，量子点闪烁可以被含巯基钝化表面的量子点抑制。这种防闪烁研究能够长期轨迹跟踪单一的量子点连接，并扩大其能力，便于研究膜蛋白或基因转运到细胞质和细胞核等。Hoang等[3]的研究表明，抗生物素蛋白受体在HeLa细胞的细胞质膜上的表达可以被生物素化的肽涂层量子点标记，并可在单一分子水平观察到这种结合物。这种方法可以揭示细胞膜上糖基锚受体与脂筏之间的关系。量子点也可用于药物和基因传递系统的单量子点信号偶联。在大多数情况下，官能化量子点带有合适的天线(如有针对性的肽序列)，可使其聚合在内涵体。Szymanski等[30]研究表明，显微注射允许发送包含功能肽序列的量子点到线粒体和细胞核。

3量子点的毒性

随着碳纳米材料，如碳纳米管和富勒烯的急剧膨胀，量子点的细胞毒性已被提出，特别是在活细胞实验中。由于材料、合成方法、增溶作用以及量子点的官能化协同使量子点毒性问题变得非常复杂。大部分报道发现，适当应用亲水壳涂层时，硒化镉量子点对细胞活力、形态及功能没有急性和明显的毒性[22,31]；但是当量子点表面涂层缺乏或Cd2+被释放时，细胞毒性可能发生，如硒化镉暴露于空气可被氧化或损坏[31]。因此，在量子点表面涂层、防止氧化损伤是活细胞和动物实验的关键。因此，需要进一步研究以阐明量子点共轭物的安全性，以便安全地进行量子点在下一个阶段的应用。

4量子点DNA探针的基因组分析

荧光原位杂交技术是一种重要的以核酸为基础的技术，其能够在细胞内可视化和映射遗传物质。该技术一般提供基因或部分基因的具体定位，以及肿瘤细胞中异常基因扩增的基因拷贝数的定量信息。常用的有机染料在荧光图像量化之前迅速被光漂白，而且当目标数目有限时检测更困难，更为严重的问题是细胞固有的自体荧光降低了信号噪声比。量子点具有足够的耐光性、宽的激发波谱以及窄的发射波长范围，因而是一种非常具有应用前景的有机染料。Xiao等[32-33]采用链霉素连接硒化镉量子点，通过荧光原位杂交技术分析人类染色体和SK-BR-3乳腺癌细胞系。此外，Luo等[5]采用荧光原位杂交技术对人类精子细胞中的Y染色体进行了检测。量子点不仅可以对人类染色体进行检测，也可以对大肠埃希菌进行检测，量子点探针可与pUC18质粒的多个克隆位点进行序列互补[34]。量子点为基因组分析技术应用于临床诊断提供了可能。

5量子点的单分子探针

分析科学的终极目标之一是单分子分析，试图只从单个分子中读出各种分子的信息。量子点因其独特的光物理性质，即光谱范围、亮度、长寿命等是实现单分子分析的潜力探针。这些特性使量子点单分子探针能长期跟踪，适用于在体内研究蛋白质动力学配体转运。量子点相对较大的尺寸、高电子密度等属性可作为分子来标记与它们结合的生物分子，并使其荧光。有研究人员在实验中利用原子力显微镜和电子显微镜，应用单量子点跟踪研究甘氨酸受体的快速横向动力学[35-36]。明亮的量子点能够观察到突触外和突触域的多个交换，其中包括甘氨酸受体在自由基与密闭扩散状态之间转变。为了量化观察结果，研究人员确定了单量子点跟踪导致的瞬时扩散系数。此外，通过电子显微成像可观察和明确甘氨酸受体扩散进入到突触。利用表面功能多样性和发射光谱窄，构建了多种颜色量子点修饰的DNA，并应用于现有的DNA诊断技术中，如SNP分型[37]、点突变的检测、单个DNA水平的DNA-蛋白质相互作用研究[38-40]。尽管已经揭示了人类基因组序列，但是更重要的是要观测何时、何种蛋白结合到DNA的何种部位并调制表达，这可采用荧光研究评估或结合荧光及静态成像技术评估，如原子力显微镜或电子显微镜，其不同于传统的有机染料，当量子点在DNA末端标记时，可进行DNA-蛋白质相互作用的动态研究。基于它们的相对高密度和大的表面积，预计会有更多重要的应用。

6结语

前文讨论了量子点的性质以及作为新型荧光探针在生物学的应用。目前，在细胞生物学中已经建立了一些量子点染色方法，但是量子点作为单分子探针的单分子分析仍然具有挑战性。虽然量子点的独特的光物理和形态特性为生物学研究提供了一个方法，但不会取代传统有机染料或荧光蛋白。

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摘要：半导体量子点(量子点)是纳米尺度的晶体，其具有独特的光物理性质，如荧光寿命较长、对光漂白有独特的稳定性、较大的带隙位移及狭窄对称的荧光谱峰，这些特性使量子点成为有前途的生物光学标记，如作为免疫荧光标记细胞和组织、DNA探针及单分子探针等。量子点可用于标记DNA序列或电化学检测蛋白质。该文就量子点的属性与毒性及其光学与电化学生物的分析应用，尤其是量子点在生物医学中的应用予以综述。

关键词：量子点；荧光探针；毒性

Study on Single Bio-Molecule Imaging of Quantum DotsYANGDan-dan,LUOXue,WANGRun-fang,RENXiao-miao,MADi,ZHANGZi-wei,WANGYan.(FirstGynecologicalWard,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract:Semiconductor quantum dots are nanometre-scale crystals,which have unique photophysical properties,such as longer fluorescence lifetime,unique stability on photobleaching,and larger bandgap displacement and narrow symmetrical fluorescence spectra peak.Such properties enable quantum dots to be the promising optical labels for the biological applications,such as immunofluorescence labeling of cells and tissues,DNA probe and single-molecule probes.Meanwhile,quantum dots can also be used as labels for the electrochemical detection of DNA or proteins.Here is to make a review of the properties and toxicity of quantum dots and their analytical applications in optics and electrochemical biology,especially the application of quantum dots in the area of biomedicine.

Key words:Quantum dots; Fluorescent probe; Toxicity

收稿日期：2014-01-10修回日期：2014-07-21编辑：辛欣

中图分类号：R114

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)05-0871-03