自噬途径常用分子生物学指标在反映自噬活性上的意义

潘明娇，王小丹(综述)，喻　陆(审校)

(1.南方医科大学研究生学院，广州 510515; 2.解放军总医院南楼保健科，北京 100853; 3.解放军第三○五医院肾科，北京 100017)



自噬途径常用分子生物学指标在反映自噬活性上的意义

潘明娇1△，王小丹2(综述)，喻陆3※(审校)

(1.南方医科大学研究生学院，广州 510515; 2.解放军总医院南楼保健科，北京 100853; 3.解放军第三○五医院肾科，北京 100017)

自噬——溶酶体体系是真核细胞中两大降解体系之一，主要负责长寿蛋白、损伤细胞器的清除，与人类多种疾病的发生、发展有关；根据底物运送至溶酶体的途径不同，自噬——溶酶体体系分为3种形式：①分子伴侣介导自噬；②微自噬；③巨自噬，即通常所说的“自噬”[1]。目前大部分自噬相关研究需通过检测自噬活性的变化来得出结论。在众多的自噬活性检测手段中，分子生物学检测技术因其简便易操控，应用十分广泛。通过了解自噬的分子机制及其与泛素蛋白酶体系(ubiquitin proteasome system,UPS)的相互关系，可以更好地利用自噬途径常用分子生物学指标对自噬活性的变化做出更为准确的判断。现对自噬途径常用分子生物学指标在反映自噬活性上的意义综述如下。

1自噬的分子机制

1.1分隔膜形成阶段分隔膜形成阶段由unc-51样激酶1复合体、Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶复合体共同参与[2]。基础情况下，雷帕霉素靶点(target of rapamycin,TOR)复合体1通过级联调控Atg基因的转录、翻译，或直接催化Atg13过磷酸化在分隔膜形成阶段负性调控自噬途径，将自噬活性保持在较低的水平[3]。然而，在营养限制等诱导条件下，TOR复合体1活性降低，使Atg13去磷酸化；去磷酸化Atg13与unc-51样激酶1的亲和性增加，两者结合后再与Atg17、Atg101共同形成unc-51样激酶1复合体[4]。同时，液泡分类蛋白34可联合Beclin1、Atg14、Atg15，将磷脂酰肌醇转化为磷脂酰肌醇三磷酸，共同组成Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶复合体[5]。unc-51样激酶1复合体、Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶复合体可介导跨膜蛋白Atg9的磷酸化及聚集，进一步促进胞质中脂质、Atg蛋白的汇聚，启动分隔膜的形成[4]。

1.2分隔膜延长阶段两种泛素样结合作用促进了分隔膜的延长。①Atg12与Atg5的泛素样结合：首先，泛素活化酶样Atg7通过腺苷三磷酸依赖途径活化Atg12，Atg12活化后与泛素连接酶样Atg10结合，并被Atg10运送至Atg5，与Atg5发生共价性结合，两者结合后再与Atg16L联接，最终形成Atg12-Atg5-Atg16L复合体，而Atg12-Atg5-Atg16L复合体定位在分隔膜的外膜上，待自噬体成熟后从膜上脱离[6]。②微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1LC3-Ⅰ, LC3-Ⅰ)与磷脂酰乙醇胺的泛素样结合：LC3是广泛存在的完整胞质蛋白，自噬诱导发生后，半胱氨酸蛋白酶Atg4将LC3水解成C端甘氨酸残基暴露的水溶性LC3-Ⅰ，Atg7识别并活化LC3-Ⅰ，活化的LC3-Ⅰ转移至泛素连接酶样Atg3，在Atg3的催化下，磷脂酰乙醇胺结合至LC3-Ⅰ C端甘氨酸残基，生成脂溶性LC3-Ⅱ[7]。LC3-Ⅱ是一类泛素样蛋白，在自噬体膜的延长、自噬体膜与其他膜结构的融合、自噬体运载“货物”等过程中起至关重要的作用[7-8]。其定位在分隔膜、自噬体膜的内外膜上，内膜被溶酶体降解后，外膜上LC3-Ⅱ被Atg4水解下来重新进入胞质[9]。以上两种泛素样结合体相互作用，共同促成分隔膜的形成及延长[8,10]。

1.3打包货物分隔膜在延长过程中，会将胞质中聚集的异常蛋白、脂滴、失功能细胞器、入侵微生物等“货物”包裹，最终闭合成完整的自噬体，这就是所谓的自噬“打包”过程[2]。以前认为自噬的“打包”是随机的，但越来越多的证据显示，有些待降解“货物”会被加以修饰或是暴露出某些特征，被相关信号蛋白或分子识别，从而被降解，这部分自噬是具有一定选择性的[9,11-12]。p62作为一类衔接蛋白，可一端通过泛素连接被标志的“货物”，另一端特异性连接分隔膜或自噬体膜上的LC3蛋白，LC3蛋白起到了类似膜受体的作用，介导了分隔膜的选择性“打包”过程，最后衔接蛋白与“货物”一起被降解；类似的衔接蛋白还有乳腺癌1号基因相邻基因1蛋白(NBR1)、核点蛋白52、optineurin等[12]。研究发现，因LC3B缺陷引起的自噬途径阻滞，p62及其连接的泛素化蛋白会出现明显的堆积[13]。因此，p62蛋白水平与自噬活性在一定范围内呈负相关[14]。

1.4自噬溶酶体形成在哺乳动物中，包裹着“货物”的完整自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，才能达到将“货物”降解的最终目的[2]。在自噬溶酶体形成之前，自噬体在tectonin结构域蛋白1、Atg12-Atg5结合体、可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着型蛋白受体、内体表面蛋白、内体蛋白分选转运装置Ⅲ、同型融合分选蛋白复合体、溶酶体相关膜蛋白、Rab蛋白、Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶复合体、热激蛋白70家族等调控下会先有一个成熟过程，这一成熟过程是自噬体与溶酶体融合的前期准备工作[15]。此外，TOR活性降低、自噬体膜与溶酶体膜融合均可提升溶酶体的活性，这都有助于自噬溶酶体维持一种酸性的降解环境，使得酸性水解酶充分发挥其生物学功能[16]。同时，溶酶体降解效率也影响着自噬的活性[17]。

2自噬与UPS的关系

UPS是真核细胞中另一个重要的降解体系，因与自噬有显著的差异，在很长一段时间里，人们认为两者是独立行使细胞质控功能的；自噬的降解过程发生在自噬溶酶体这样的囊泡样结构中，而UPS的酶促反应则直接在胞质中进行；自噬的底物广泛，UPS的底物则是严格的可溶性蛋白；自噬可以有选择地进行，也可以无选择地进行，而UPS则是具有严格选择性的[18]。

2.1自噬与UPS活性相互影响当UPS缺陷时，自噬活性会补偿性地提高[19]，其原因可能是UPS缺陷时，某些Atg基因转录水平上调，或者是TOR等自噬负性调节因子受抑制[20-21]。自噬缺陷时，细胞泛素化蛋白则会增多，这一现象的一种解释是自噬的泛素化蛋白底物堆积；但大多数学者倾向的另一种解释是自噬活性下降后，自噬底物堆积，UPS接替自噬的质控工作，泛素逐渐标志堆积的自噬底物，但是由于自噬活性降低也会使细胞内包括p62在内的自噬相关泛素连接蛋白降解减少，逐渐增多的自噬相关泛素连接蛋白与其他UPS相关泛素连接蛋白(如p97)，竞争性结合泛素化蛋白，使得UPS途径中断，最终导致大量泛素化蛋白堆积[18,22-23]；类似的自噬相关泛素连接蛋白还有NBR1、组蛋白脱乙酰基酶6和Alfy[12,24]。

2.2自噬与UPS的底物或成员相互影响①某一降解体系的底物是另一降解体系的“激动剂”或“抑制制”，如p53是UPS的降解底物，但同时又能通过TOR信号途径上调或下调自噬活性[25-26]；②两者的成员可互为彼此的降解底物，如泛素可被自噬和分子伴侣介导自噬降解[27]，蛋白酶体可被自噬降解[28]，这些互为底物的成员可能是两种蛋白降解体系相互影响的关键所在。

3自噬常用分子生物学指标

目前，研究自噬途径常用的分子生物学指标有LC3、Atg12-Atg5、TOR、p62、p53以及UPS相关标志物(如多聚泛素、小泛素相关修饰蛋白等)，主要是从这些指标的转录、翻译水平间接反映自噬活性[29-30]。LC3-Ⅱ结合在自噬体膜上，是目前唯一的自噬体标志蛋白，其蛋白水平与自噬体数量呈正比[31]。常用LC3-Ⅱ/LC3-I比值来提示自噬活性，类似的还有Atg12-Atg5蛋白或信使核糖核酸水平，但容易出现假阳性结果，究其原因如下：①自噬是一个动态的途径，因此，该途径通畅无阻且降解效率升高才能说明自噬活性提高，但LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Atg12-Atg5水平提高只能说明自噬体增多，而自噬体增多除了是因为自噬活性提高，也可能是由于自噬体与溶酶体结合障碍，或自噬溶酶体降解障碍引起；②脂溶性LC3-Ⅱ较水溶性LC3-Ⅰ的抗体结合力强，通过抗体结合的方法来反映两者蛋白水平会出现误差；③LC3-Ⅱ和Atg12-Atg5在自噬溶酶体形成后会被释放回胞质，细胞内LC3-Ⅱ和Atg12-Atg5水平并不能准确反映自噬体的数量或活性[32]。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化率、Atg12-Atg5水平与细胞种类、刺激类型有关，并不单单取决于自噬活性[30]。了解自噬的分子机制及自噬与UPS的关系后可知，TOR是自噬途径的负性调控因子，其活性与自噬活性呈此消彼长的关系；p62作为自噬的底物，其蛋白水平下降可提示自噬活性的提高；p53可上调或下调自噬活性，通过其蛋白或信使核糖核酸水平对自噬活性进行解读应密切结合其他指标及检测手段；UPS活性与自噬活性存在一定的互补性[19-21]，因此多聚泛素、小泛素相关蛋白的水平下降也可在一定程度上提示自噬活性的提高。值得一提的是，静态观察上述分子生物学指标并不能准确反映自噬活性的变化，除了电镜下观察自噬体数量及形态，还需结合LC3蛋白Turnover实验、长寿蛋白降解率、LC3和其他选择性自噬底物降解率等自噬潮分析，所得的结论更具有说服力[29]。

4小结

自1963年诺贝尔奖获得者de Duve首次对“自噬”进行定义以来，已经过半个多世纪[33]。随着科研技术的进步，人们对自噬的了解也越来越深入，大部分学者认为自噬具有双面性。通过对自噬分子生物学指标的正确解读，有助于发现自噬在肿瘤、神经退行性疾病等疾病不同时期的活性变化，进而有针对性地通过增强或抑制自噬活性对疾病进行干预，有望达到缓解或治愈疾病的目的。

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摘要：自噬是一种真核细胞自我降解、维持自稳态的细胞途径，在进化过程中高度保守，主要负责降解长寿蛋白和损伤细胞器。近年来，关于自噬的研究较多，其中许多研究需要通过观察自噬活性的变化来得出结论，因此准确解释自噬活性检测结果十分重要。在众多自噬活性检测方法中，分子生物学检测技术应用较为广泛，通过了解自噬的分子机制及其与泛素蛋白酶体系的关系，可以更好地利用自噬途径常用分子生物学指标来反映自噬活性变化。

关键词：自噬；分子生物学指标；分子机制；泛素蛋白酶体系

The Significance of Common Molecular Biomarkers of Autophay Pathway in Reflecting Autophagic ActivityPANMing-jiao1,WANGXiao-dan2,YULu3.(1.PostgraduateSchool,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515，China; 2.HealthCareDepartment,SouthWing,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China; 3.DepartmentofNephrology，ChinesePLA305Hospital,Beijing100017,China)

Abtract:As a self-degradative cell pathway in eukaryotic cells,autophagy is evolutionarily conserved and mainly responsible for the degradation of long-lived proteins and damaged organelles.Autophagy is also conducive to maintaining the normal cellular homeostasis.The past decades have witnessed a remarkable progress of research on autophagy.A great number of studies obtain their conclusions through observing the change of autophagic activity,therefore it is important to correctly explain the results from the autophagy activity test.Among the test methods,the molecular biological methods are widely used,and through clarifying the molecular mechanisms of autophagy and the relationship between autophagy and ubiquitin proteasome system,we could make better use of the common molecular biomarkers to reflect the change of autophagic activity.

Key words:Autophagy; Molecular biomarkers; Molecular mechanisms; Ubiquitin proteasome system

收稿日期：2014-07-28修回日期：2014-09-10编辑：郑雪

基金项目：国家自然科学基金(81370452)

中图分类号：Q71
doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.006

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)05-0784-03