输血前血液筛查中新型HBV基因突变及抗原分析的研究

孙玲玲，孙伟峰，张　震（通讯作者）（南京医科大学附属无锡市人民医院　输血科；南京医科大学附属无锡市人民医院　医学检验科；无锡市中心血站，江苏无锡40）



输血前血液筛查中新型HBV基因突变及抗原分析的研究

孙玲玲1，孙伟峰2，张震3（通讯作者）
（1南京医科大学附属无锡市人民医院输血科；2南京医科大学附属无锡市人民医院医学检验科；3无锡市中心血站，江苏无锡214023）

〔摘要〕目的：分析研究输血前血液筛查中新型HBV基因突变及抗原特点，评价核酸检测技术（NAT）在输血前检查中的应用价值。方法：选取我血液中心采集的血液标本40421份，采血并进行ELISA、ALT、血型检测、NAT检查，ELISA采用双抗原夹心法检测抗原、抗体，NAT检查采用全自动生化检验，以病毒核酸提取试剂盒提取血清标本病毒DNA，进行PCR扩增、产物纯化，进行DNA测序、序列分析，对于ELISA （-），NAT（＋）献血者进行跟随随访，分析乙肝表面抗原变化情况。结果：ELISA筛查HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2中有1项为反应性标本占96.99%，NAT检查阳性率7.92×10-4（31/40421），10例HBV/HCV/ HIV阴性，HBV DNA反应性占70.00%，21例HBV DNA反应性标本，病毒含量11～84IU/ml，平均（15.5±2.3）IU/ml；随访12个月以上，25例随访1～5个月，HBsAg抗原转为阳性1例、HBV NAT检查转为阴性3例，维持原样21例，乙肝窗口期3例、隐匿性感染12例，对血样进行乙肝“两对半”检查，其中HBsAg阳性1例、HBcAb阳性21例、HBsAb阳性13例、HBcAb单阳性6例，随访变为3、17、12、3例。结论：输血前血液筛查中新型HBV基因突变可能是致抗原阴性的重要原因，进行NAT检查有助于发现窗口期、隐匿性HBV感染。

〔关键词〕乙型肝炎病毒；肝炎；输血；血液筛查；基因突变；抗原分析

输血是临床常用的治疗手段，挽救了数以亿例患者生命。乙型病毒性肝炎是一种以乙型肝炎病毒（HBV）为病原体的传染病，我国是乙肝高发国家，乙肝表面抗原携带率高达10%～11%，其中相当一部分无特异性症状表现，为隐性感染，输血前进行乙肝检验非常必要，有助于保障输血安全[1]。ELISA是检查HBsAg主要方法，但灵敏度较低，近年来核酸检测技术（NAT）逐渐受到医学界重视，敏感度高，可有效提高感染“窗口期”检出率，发现隐匿性感染、病毒变异株。我市中心血站对无偿献血血样开展NAT检查，现报道如下。

1　资料及方法

1.1一般资料

2012年1月至2013年12月，血液中心采集的血液标本40421份，采血并进行ELISA、ALT、血型检测、NAT检查。

1.2方法

血液标本2～8℃冰箱保存，4h内，1500 g离心20 min，分离血浆，2～8 ℃冰箱保存，完成各项检测。ELISA采用双抗原夹心法检测抗原、抗体，NAT检查采用全自动生化检验，ELISA测定HBsAg阴性、抗HCVAb阴性、抗HIVAb阴性样品，并对三项标本进行三项病原体检测，提取核酸，以扩增检测系统检测标本。以病毒核酸提取试剂盒提取血清标本病毒DNA，进行PCR扩增、产物纯化，进行DNA测序、序列分析。对于ELISA（-），NAT（＋）献血者进行跟随随访，分析乙肝病毒表面抗原变化情况。对以上说的HBsAg ELISA（-）、NAT（＋）标本，以电化学发光法进行乙肝五项检查，并评价乙肝病毒感染免疫情况，合适NAT抗体表达，诊断是否为窗口期、隐匿性感染[2]。

1.3统计学处理

2　结果

2.1基本情况

40421份检查，ELISA筛查HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2中有1项为反应性标本39 204份，经NAT检查，见31例反应性标本，检出率为7.92×10-4，进行复检，NAT检查仍为阳性，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2中结果无变化。将31例标本送检，10例HBV/HCV/HIV阴性，21例HBV DNA反应性，占70.00%，检出病毒，且病毒为HBV，HCV RNA、HIV RNA为阴性。21例HBV DNA反应性标本，病毒含量11～84 IU/ml，平均（15.5±2.3）IU/ml，其中<20 IU/ml者20例，占95.24%。40 421份样本中，ELISA检查HBsAg阳性1782份，检出率4.41%，双试剂反应阳性1108份，占2.84%、单试剂反应阳性624例，占1.54%[3]。

31例NAT反应性标本进行PCR扩增，8例电泳见特异性条带，其余扩增反应不佳，产物量较小。对31例ELISA（-），NAT（＋）献血者进行跟随随访，随访12个月以上，其中6例失访，25例随访1～5个月，其中ELISA检查HBsAg抗原转为阳性1例、HBV NAT检查转为阴性3例，维持原样21例。后经诊断，乙肝窗口期3例、隐匿性感染12例[4]。

2.2抗体检测

31份ELISA（-），NAT（＋）献血者，对血样进行乙肝“两对半”检查，其中HBsAg阳性1例、HBcAb阳性21例、HBsAb阳性13例、HBcAb单阳性6例。随访，再次取对象血样，复查，HBsAg阳性3例、HBcAb阳性17例、HBsAb12例、HBcAb单阳性3例。

2.3典型病例

1例确定为窗口期标本，首次HBV、HCV、HIV，重复检查均显示正常，NAT检查阳性，为“窗口期”，Ct=33.4。跟踪随访1周，复查，进行HBV、HCV、HIV核酸检测，Ct=30.1，病毒拷贝可能增多，但进行电化学发光法进行乙肝五项、HCV、HIV检查，仍为阴性。继续随访，第6周，复查HBV、HCV、HIV核酸检测仍为阴性，Ct=23.2，乙肝五项检查，HBsAg、HBeAg转为阳性，诊断为乙肝感染，传染性增强。第12周复查，混样模式检查HBV、HCV、HIV核酸，Ct=28.4，又发生变化，电化学发光检查HBeAb为阳性，HBsAg转为阴性，乙肝病毒复制不活跃，提示HIV感染时间已较长，病毒趋于稳定，HBVDNA可能与宿主DNA开始或已经整合。

3　讨论

输血安全关系个人生命健康安全，输血所致感染是医疗纠纷发生重要原因之一，临床上常以两次酶联免疫吸附法进行病毒检测，但实际情况是，因HBV窗口期较长、假反应性较高等原因，仍有少部分被漏诊，携带HIV病毒血液被输注，受血者被感染。血液感染主要原因包括为病毒感染窗口期献血、病毒变异、隐匿感染输血、实验室差错[5]，我国因各地区输血安全管理水平参差不齐、个人输血安全意识较差，血液病毒残存率较高，本组患者ELISA筛查HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2中有1项为反应性标本占96.99%，不合格者占3.01%，血液质量亟待提高。经NAT检查发现，ELISA（-）、NAT（＋）阳性率7.92×10-4（31/40 421），提示单纯的ELISA三联检测仍不能完全保证血液合格。研究显示，ELISA（-）、NAT（＋）阳性者，HBV DNA反应性占70.00%，其中病毒含量11～84IU/ml，平均（15.5±2.3）IU/ml，提示NAT可检出隐匿性、窗口期乙肝病毒感染，隐匿性感染可能与基因突变有关，后经随访证实，乙肝“两对半”检查，血样HBsAg阳性1例、HBcAb阳性21例、HBsAb阳性13例、HBcAb单阳性6例，随访变为3、17、12、3例，患者病毒活跃性发生变化。

第四代酶联免疫吸附测试已可将输血风险将至1/100万级，但技术本身存在一定缺陷，尽管检测抗原、抗体，窗口期、潜伏期患者献血仍无法避免，造成漏检，NAT检测已成为部分发达国家传染病筛查重要方法，但因成本、价格等原因尚未得到普及，但该技术仍有巨大的发展潜力。

［参考文献］

［1］ 王晓军，张荣珍，胡苑笙，等.我国病毒性肝炎流行现状研究[J].疾病监测2014，29（8）：290-292.

［2］ 林宇，李颂华，王如伟.日本对慢性乙型肝炎和肝硬化的治疗研究概述[J].中国药学杂志，2012，47（18）：1444-1449.

［3］ 中华医学会感染病学分会，中华医学会肝病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J].中国预防医学杂志，2011，12（1）：1-15.

［4］ 张梅香.输血前传染病检测在输血中的应用价值探究[J]. 数理医药学杂志，2014，（06）：735-736.

［5］ 冷婵.血液HCV筛查策略的探讨[D].北京：军事医学科学院，2012.

收稿日期：2015-06-21

〔中图分类号〕R575；R512.6+2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1002-2376（2015）10-0100-02