Smurf2对肝纤维化中TGF-β/Smad通路的影响

骆菁怡,张立婷,鲁明霞,颜小明(综述),肖　萍(审校)

(　1.汉中职业技术学院医学系，陕西 汉中 723000； 2.兰州大学第一医院东岗分院肝病科，兰州 730000；

3.兰州大学第一临床医学院，兰州 730000； 4. 兰州大学第一医院传染病研究室，兰州 730000)

Smurf2对肝纤维化中TGF-β/Smad通路的影响

骆菁怡1※,张立婷2,鲁明霞2,颜小明3△(综述),肖萍4(审校)

(1.汉中职业技术学院医学系，陕西 汉中 723000； 2.兰州大学第一医院东岗分院肝病科，兰州 730000；

3.兰州大学第一临床医学院，兰州 730000； 4. 兰州大学第一医院传染病研究室，兰州 730000)

摘要：转化生长因子β1(TGF-β1)在肝纤维化的发生、发展中起重要作用，它作为TGF-β1/Smad信号通路的起始因子激活下游信号，使处于非活性状态下的肝星状细胞分化为肌成纤维细胞，促进并维持了肝纤维化的发生。泛素化是体内蛋白质翻译后修饰并降解的重要途径之一，泛素-蛋白酶体途径中的泛素连接酶Smurf2通过多种途径抑制TGF-β1/Smad通路表达。Smurf2作为一种抗肝纤维化发生的酶受到广泛关注，但机制并未深入系统地被阐述。

关键词：肝纤维化；转化生长因子β1/Smad；泛素；Smurf2；肝星形细胞

肝病是我国的高发病之一，肝纤维化是指各种由慢性疾病引起的肝脏持续创伤修复反应，从而导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积和肝脏功能受损的病变[1]。肝纤维化是各种损伤引发慢性肝病、肝硬化及肝癌的共同病理基础和必经阶段[2]，肝星形细胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化、增殖是其发生的关键细胞学基础[3]。肝脏可能在持续的肝细胞破坏和再生下发展为广泛的正常肝细胞结构异常，进而发展为肝纤维化，所以控制肝纤维化产生是防止肝硬化发生的重要关口，但现今还没有有效的抗纤维化治疗，所以研究肝纤维化产生的机制显得尤为重要。主要导致肝纤维化的细胞是HSC，在成人的肝脏中，未活化的HSC位于肝细胞和肝窦内皮细胞之间，当肝脏受到损伤，HSC被激活，分化为肌成纤维细胞，并增殖扩散，产生主要成分为胶原的ECM。急性损伤后，活化的HSC可促进肝细胞增殖和器官修复，但在慢性损伤中，过多的ECM打乱了正常的肝细胞结构，导致肝纤维化和肝硬化[4]。现就Smurf2对肝纤维化中转化生长因子(transforming growth factor-beta,TGF-β)1/Smad通路的影响进行综述。

1肝纤维化发生的机制

1.1TGF-β1/Smad信号通路

1.1.1TGF-βTGF-β是一类由结构、功能相关的多肽生长因子亚家族组成，具有旁分泌、自分泌作用的超家族，包括至少25种相关蛋白，其中TGF-β1占主要部分。TGF-β1在多种细胞反应中扮演主要角色，起着细胞增殖、凋亡、分化、迁移、附着、血管形成、刺激ECM产生和促使ECM降解等广泛的生物学作用[5]。目前认为，TGF-β1在促进HSC分泌胶原中发挥重要作用，是致纤维化最主要的细胞因子[6]。TGF-β1以无活性的形式被分泌，但在应激状态下，潜在的TGF-β1复合物被组织-伤害特定机制激活而发挥生物学效应。在肝脏中，TGF-β1可由多种细胞分泌产生，包括实质细胞及间质细胞，如库普弗细胞、内皮细胞、肝细胞、HSC等。在肝纤维化的发展过程中，TGF-β可激活纤维化细胞因子和促使肝星状细胞分化为肌纤维细胞，持久的TGF-β刺激可导致ECM堆积和金属蛋白酶组织抑制剂的合成，激发肝纤维化产生[5，7]。

1.1.2TGF-β受体(TGF-beta receptors,TβR)TGF-β1和TβR在活体组织中广泛表达，TGF-β1与靶细胞表面相应的TβR结合后激发下游信号产生。TβR有3种(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)，其结构相似，分为膜外区、跨膜区、膜内区，其中Ⅰ型和Ⅱ型为信号传递受体，跨膜区内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域具有细胞信号转导所必需的丝氨酸/苏氨酸蛋白酶活性，与受体后细胞内信号转导有关[8]；Ⅰ型受体的胞质近膜区含有高度保守的丝氨酸和甘氨酸结构域，是受体激酶活性的作用区域；3种类型的TβR膜外区均富含半胱氨酸。

1.1.3Smad的分类及功能Smad为TGF-β超家族特异性受体后信使蛋白分子，通过介导TGF-β信号从细胞膜传入细胞核而发挥中介功能。目前发现有8种Smads蛋白，根据各自在信号转导中的功能不同将其分为3类：①受体Smad(R-Smad)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，这一类Smad是TGF-β受体复合物下游作用的靶分子，可被活化的TβRⅠ识别，其中Smad2和Smad3与TβRⅠ结合，形成转录复合体，与靶基因的特定部位结合，参与TGF-β信号转导，R-Smad 的磷酸化状态决定Smad复合体的入核与出核、结合与分离，因此在TGF-β信号通路中是最关键的因子[9]。②协同Smad(Co-Smad)，主要是Smad 4。R-Smad与Smad4结合后形成异源复合物，能进入细胞核调节转录，所以Smad4是TGF-β信号转导必需的中间分子。③抑制型Smad(I-Smad)，包括Smad6和Smad7。Smad7与TβRⅠ的紧密结合产生竞争性拮抗占据作用，占据了Smad2、Smad3与活化型TβRⅠ的结合位点从而阻断依赖TGF-β1的Smad2/Smad4复合物的形成，从而对TGF-β1信号转导通路起负调控作用[7，10]。

TGF-β/Smad信号通路表达的基本过程为：刺激因子作用于HSC后，处于自动磷酸化状态的TβRⅡ在TβRⅢ的辅助作用下与TGF-β配体结合后激活跨膜TβR，Smads蛋白被跨膜受体磷酸化，该Smad再与协同Smad即Smad4结合，形成复合物后转入细胞核内，激活的复合物和两类DNA结合辅助因子结合，决定靶基因的转录活性[11]。Smad复合体进入细胞核后与靶基因启动子的特异序列结合形成稳定的复合物，间接地对靶基因进行调节。同时，Smad复合体直接与细胞核内DNA结合进而直接激活目的基因的转录。HSC活化后分泌大量ECM沉积在肝细胞间，同时活化后的HSC可自分泌TGF-β1而形成级联环状放大反应促使纤维化发生。

1.2非TGF-β1/Smad信号转导路径促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/Akt及核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路等可直接由TGF-β介导，也可间接参与调节TGF-β1/Smad通路的信号转导。Smad信号转导与非Smad信号转导间存在广泛联系，并对Smad信号转导通路进行调节。在一些细胞中非Smad信号通路尤为重要，但TGF-β/Smad信号通路是目前公认的致纤维化的主要通路。

2以TGF-β/Smad通路为靶点的抗纤维化治疗

研究发现，TGF-β通路在肝纤维化产生与发展中起重要作用，因此干扰其信号转导成为抗纤维化研究的重要方向。研究主要集中在如何抑制TGF-β本身、干扰受体与配体结合及抑制其活性、对TGF-β下游信号的负性调节[12]。

2.1针对TGF-β抑制肝纤维化产生通过抑制TGF-β的产生可在理论上降低肝纤维化的发生。有研究证实，肾素-血管紧张素系统可促进TGF-β的分泌合成，应用血管紧张素转换酶抑制剂及血管紧张素受体阻断剂后，实验大鼠纤维化肝脏中TGF-β mRNA表达下降，TGF-β蛋白明显减少[12]。体外实验证实重组肝细胞生长因子也可阻断TGF-β mRNA表达。另外，TGF-β产生后阻断其激活也具有抗纤维化的重要意义，肝细胞中存在多种TGF-β前肽复合物激活因子，通过干扰激活因子与相关肽的作用可以阻止肝脏损伤及肝纤维化形成。

2.2作用于TGF-β受体TGF-β的生物信号通过TβRⅠ和TβRⅡ传递，通过阻断TGF-β与其受体的结合是防治肝纤维化的有效途径之一，或通过竞争性结合活性受体阻断信号转导。Ueno等[13]构建了融合人IgG的TβRⅡ外功能区的腺病毒载体，在纤维化大鼠中应用可溶性TβRⅡ，使其与胞膜TβRⅡ 竞争性结合，可降低HSC的激活和增殖，抑制了TGF-β通路信号的传递。

2.3针对TGF-β下游信号转导Smads蛋白分子是TGF-β唯一的受体后蛋白，通过抑制Smads蛋白分子的生成、磷酸化和核转位可抑制肝纤维化的发生[14]。Dooley等[15]向大鼠注射携带有Smad7 cDNA的腺病毒载体后发现，Smad7高表达的大鼠胶原含量降低从而HSC激活受到抑制。也有体外报道Smad7通过抑制Smad2/3磷酸化及活化的Smad复合物核转位，对已经形成的肝纤维化也有影响。降低组织中Smad3、Smad4的含量或使其活性降低，也能抑制肝纤维化的发生、发展。

因此，TGF-β家族对肝纤维化既有正调控作用，又有负调控作用，所以在阻断TGF-β通路从而抑制肝纤维化发生时，不能将所有的TGF-β作用都阻断。因此从理论上推测，针对TGF-β下游信号转导的阻断将更具有特异性。由于Smads是TGF-β信号通路中关键调节因子，因此改变Smads蛋白水平可影响信号转导及转导产物形成。Smad泛素化调节因子2(Smurf2)可通过多种途径抑制TGF-β下游信号转导而引起广泛关注。

3泛素-蛋白水解酶复合体通路及Smurf2对肝纤维化的影响

泛素-蛋白水解酶复合体通路(ubiquition-proteasomepathway,UPP)是真核细胞内高度保守且具有高度选择性，依赖三磷酸腺苷的重要蛋白质降解途径。细胞内80%～90%的蛋白质通过UPP降解，其在抗原呈递、细胞分化、凋亡、蛋白质的翻译和转录中发挥着非常重要的作用[16]。多项研究表明，其异常表达与器官囊性纤维化、肿瘤、神经性病变及肝脏疾病等关系密切。2004年诺贝尔化学奖授予了在“泛素介导的蛋白质降解过程研究”中做出贡献的三位来自以色列和美国的科学家，以表彰他们发现了UPP。

UPP是由泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素-蛋白结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2)、泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligases,E3)、泛素(ubiquitin,Ub)及26S蛋白酶体和泛素解离酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)组成，通过两个相对独立的过程对靶蛋白进行降解：靶蛋白泛素化修饰；多聚泛素化修饰的靶蛋白被26S蛋白水解酶复合体识别，降解。E1的半胱氨酸残基泛素与C端甘氨酸残基间形成高能硫酯键而获得活性，泛素在ATP的作用下被E1催化；E1-泛素结合体再将有活性的泛素转移给E2，形成E2-泛素结合体；E3直接或间接与底物结合后，促使泛素从E2转移到靶蛋白的赖氨酸残基上，形成异肽键[17]。当一个泛素分子与靶蛋白形成异肽键后，其他一些泛素分子通过E3的催化，与底物相连的泛素分子第48位赖氨酸残基相连，形成一条多聚泛素链而完成泛素化，后被蛋白酶体降解。人体中蛋白酶体在细胞核与细胞质内发挥生物效应，主要是26S蛋白酶体。26S蛋白酶体由20S和19S复合体组成，26S蛋白酶体将被泛素化标记的蛋白包裹，20S催化中心将其分解成多个氨基酸残基的小肽，同时，泛素分子从底物上水解下来，进入下一轮泛素化重复利用。

E3为具有特异性识别功能的泛素蛋白连接酶，在泛素化过程中决定了降解蛋白的特异性。Smurf2是泛素连接酶E3的一种，是C2-WW-人类乳头状瘤病毒E6相关性蛋白同源C端(C2-WW-HECT)的同系物[18]，在TGF-β1/Smad信号通路中通过多种途径介导信号通路转导，参与肝纤维化的发生、发展。

3.1Smurf2作用于SmadsSmurf2可选择性作用于R-Smads蛋白，其中Smad 2、Smad 3含有PPXY序列，因此Smurf2可以通过WW结构域与之结合，Smad4因不含脯氨酸-酪氨酸PPXY序列，Smurf2无法直接与Smad4相连，只能通过间接途径进行调控[19]。研究表明，细胞单独转染Smad7基因时不能改变细胞内Smad4水平，单独转染Smurf2时只能轻微下调Smad4的表达水平，但如果同时转染Smad7和Smurf2，Smad4表达明显下调，Smad7作为中间介质可促使Smurf2泛素化Smad4[20]。此外，Smad 7能够通过帮助Smurf2募集E2激活连接酶活性，在Smurf2调节TGF-β通路中发挥多重作用。

Smurf2能靶定被激活的Smad 1、Smad2使之降解，促进Smad2降解过程通过Smurf2的E6-AP羧基末端同源结构域催化激活及蛋白水解酶途径完成。因此，Smurf2的异位表达降低了Smad1、Smad2蛋白表达，但不能减少Smad3的表达。Smurf2的水平在纤维化大鼠肝脏中增高，但在肝硬化大鼠和人类中下降，过度表达的Smurf2使HSC胶原产生减少[21]。

3.2Smurf2作用于TβR人HSC细胞中Smurf2过表达降低了TβRⅠ和Smad7的水平，同时ECM和层粘连蛋白水平下降。在TGF-β的刺激下，Smurf2募集Smad7在细胞核内形成复合物，在TGF-β的刺激下，复合物转移至细胞质，接下来这一复合物与TβRⅠ相互作用，通过UPP使TβRⅠ表达水平下调，因此阻断了TGF-β通路的信号传递[17]。

Bizet等[22]利用反义RNA下调Smurf2后发现TβRⅠ蛋白水平增高，但在单侧输尿管闭塞模型中发现，Smurf2同时可降解Smad7，最终导致小管间质性纤维病变。

3.3Smurf2与转录共抑制因子在肝纤维化中的关系Ski和SnoN是转录共抑制因子的核内蛋白，在细胞核内它们通过与TGF-β信号通路中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad4复合体结合来抑制其活性，也通过募集转录抑制物及阻止转录共激活物与Smad2、Smad3、Smad4复合体结合等途径阻碍TGF-β/Smad通路中靶基因的转录[23]。而Ski/SnoN蛋白可被Smurf2泛素化降解，从而间接调节TGF-β信号转导。研究表明，Smad2可介导Smurf2进入细胞核降解SnoN[23-24]。

Smurf2的表达水平与Ski/SnoN蛋白降解水平同步，即Smurf2表达增强时相应Ski/SnoN蛋白泛素化降解水平增强，相反，当Smurf2表达下降时相应Ski/SnoN蛋白泛素化降解水平减弱[24]。

4小结

Smurf2 mRNA的表达水平随着TGF-β1的表达增高而增高，因此在肝纤维化发生、发展的早期，用各种方法诱导和提高Smurf2的表达可在一定程度上阻止肝纤维化的进展和肝硬化的发生[25]，但Smurf2也能通过降解转录共抑制因子上调TGF-β信号转导。虽然Smurf2作用于TGF-β通路的各个环节已经被人们的研究揭示，但现今的研究结果仍不能明确究竟是什么原因导致了Smurf2对TGF-β通路的双向调节、什么情况下Smurf2对TGF-β通路的净作用是抑制的、在Smurf2调节肝纤维化发生的同时会不会对肝脏产生不良反应，由于并非所有的TGF-β作用都应被阻断，那么Smurf2在哪个环节调节TGF-β信号转导能够在不影响正常生理功能的同时阻止肝纤维化的发生。Smurf2为预防和控制肝纤维化及肝硬化的发生、发展提供了新思路。

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Smurf 2 Impact on TGF-β/Smad Pathway in Liver FibrosisLUOJing-yi1,ZHANGLi-ting2,LUMing-xia2,YANXiao-ming3,XIAOPing4.(1.DepartmentofMedicine,HanzhongVocationalandTechnicalCollege,Hanzhong723000,China; 2.DepartmentofHepatology,theFirstHospitalofLanzhouUniversity,DonggangBranch,Lanzhou730000,China; 3.TheFirstClinicalMedicineCollegeofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China; 4.InstituteofInfection,theFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

Abstract:Transforming growth factor β1(TGF-β1) plays an important role in the development of liver fibrosis,as an initiative factor of TGF-β1/Smad pathway,it could activate downstream signals,which makes the inactive hepatic stellate cells to differentiate into myofibroblasts,promoting and maintaining the state of fibrosis.Ubiquitination is one of the important in vivo ways of translational modifications and protein degradation,and Smurf 2 ubiquitin ligase in ubiquition-proteasome pathway suppresses the expression of TGF-β1/Smad pathway through a variety of ways.Smurf 2 as an anti-hepatic fibrosis enzyme has attracted wide attention,but the mechanisms have not been systematically elaborated.

Key words:Liver fibrosis; Transforming growth factor-β1/Smad; Ubiquitin; Smurf2; Hepatic stellate cells

收稿日期：2014-07-28修回日期：2015-04-02编辑：楼立理

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.016

中图分类号：R575; R329.2

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)17-3113-04