树鼩丙型肝炎动物模型研究进展

周玲丽，杨　春(综述)，曹　骥※(审校)

(1.广西壮族自治区肿瘤防治研究所实验研究部，南宁530021； 2.广西医科大学研究生学院，南宁 530021)



树鼩丙型肝炎动物模型研究进展

周玲丽1,2△，杨春1(综述)，曹骥1※(审校)

(1.广西壮族自治区肿瘤防治研究所实验研究部，南宁530021； 2.广西医科大学研究生学院，南宁 530021)

摘要：丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球关注的公共健康问题之一。只有建立稳定可靠的HCV感染模型,才能更好地研究HCV感染慢性化和致癌的机制,从而推动丙型肝炎疫苗的研制和抗丙型肝炎药物的筛选。HCV宿主范围特别狭窄，只有人和黑猩猩对其易患。目前有一些体内和体外的实验结果初步显示，树鼩是目前继黑猩猩之后唯一能感染HCV的动物。该文对HCV感染树鼩动物模型的研究进展予以行综述。

关键词：丙型肝炎病毒；树鼩；动物模型

近年来，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)严重威胁着人类的健康，1990年至2005年，全球丙型肝炎抗体血清阳性率的患者从2.3%增加至2.8%，感染人数从1.2亿增加到1.85亿[1]。HCV的主要传播途径有血液传播、母婴传播和不安全的注射等。持久的HCV感染通常会导致慢性肝炎,其病理变化特征向着肝细胞坏死、炎症和纤维化发展,部分纤维化患者最终会变成肝细胞癌。目前治疗丙型肝炎的药物主要有干扰素、利巴韦林等，但是治疗效果不理想、成本高且不良反应显著。目前最有效保护易患者和控制病毒传播的方法是接种疫苗。由于HCV感染机制尚不清楚,尤其是缺乏合适可靠的小动物模型,严重阻碍了丙型肝炎疫苗的研制。该文主要围绕HCV体内和体外感染途径，探讨树鼩丙型肝炎动物模型。

1HCV

HCV是一种具有脂质外壳的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科。HCV通过宿主因素和病毒本身相互作用进入肝细胞是产生感染的第一步；病毒侵入肝细胞基本过程主要包括病毒与肝细胞结合，后期绑定和融合；病毒与核内体膜融合后病毒基因组释放到胞质中，完成复制和翻译；HCV颗粒进行组装最后从宿主细胞释放[2]。HCV感染宿主有多种受体蛋白介导：CD81与Claudin-1、LDLr、SR-BI[3]、Occludi[4]等，niemann-pick C1-like 1(NPC1L1)分子[5]是近2年来新发现的介导HCV感染的分子，也是新发现的抗病毒靶点。

2树鼩丙型肝炎动物模型

2.1树鼩的生物学特性和医学应用价值树鼩外形酷似松鼠，属哺乳纲，介于灵长目和食虫目之间，主要栖息于热带和亚热带森林、灌丛、村落附近。最新研究观点认为，树鼩亲缘关系最为接近于灵长类，解决了树鼩与灵长总目的系统发育关系的争议[6-7]。树鼩具有个体小、易操作、价格相对便宜、繁殖周期短等优点。我国野生树鼩主要分布在云南、广西、广东及海南等地，目前用于科研的树鼩主要来自云南，属于滇西亚种。有学者破译并分析了树鼩全基因组，研究树鼩的免疫系统相关基因，发现树鼩的HCV感染相关基因与人类保持高度的一致性，但是DDX58基因在树鼩基因组中缺失；DDX58基因对于激活核因子κB通路有着重要作用，其可以产生对抗病毒的干扰素，丧失DDX58基因的树鼩免疫反应中断，可能会导致树鼩对HCV的易患性增加[7-8]。树鼩的许多分子和细胞结构与人类相似,被用于多个研究领域，如感染性疾病的模型甲、乙、丙、丁型(病毒性肝炎)、耐药细菌感染和败血症模型、精神和神经疾病模型(心理应激和抑郁症动物模型、树鼩近视模型、树鼩老年痴呆模型)、代谢性疾病模型(糖尿病)、癌症模型(乳腺癌模型、肝癌、淋巴瘤、肺癌)等[9]。树鼩在医学界的应用价值越来越受到人们的重视。

2.2HCV体内感染树鼩模型王海平等[10]用HCV RNA阳性人血清成功感染了6只成年树鼩,说明树鼩可成为HCV易患动物。刘志等[11]用HCV RNA阳性的血清接种10只树鼩，结果得出HCV能感染树鼩，并且还产生了慢性病变。有学者用亚型为1b的HCV病毒血清感染树鼩，接种丙型肝炎患者血浆后20%～35%的树鼩血浆中HCV RNA 含量可达约104IU/mL，且出现一过性病毒血症[12]。Amako等[13]用HCV基因型(1b型)患者的血清和培养产生的病毒接种到树鼩体内，树鼩出现HCV RNA间歇阳性，丙氨酸转氨酶升高(最高值达75 U/L)，且提取阳性血清可以感染新的树鼩。这是首次发现树鼩发生了肝组织纤维化和癌变。Xu等[14]用含HCV基因1b、2c、3b、6的4种基因型的人血清和HCV转染细胞的培养上清分别接种到树鼩体内，发现树鼩可被HCV感染，并且感染呈慢性病程。王佳[15]选高拷贝HCV患者的血清皮下和腹腔注射15只树鼩，其中6只携带HCV长达28周，实验结果显示，HCV RNA阳性率为33.33%，抗HCV的阳性率为100%，实验中丙氨酸转氨酶水平出现波动且比实验前高。匡德宣等[16]选用22只人工驯养成年仔树鼩(中缅树鼩滇西亚种)，采用横切打开树鼩腹腔，肝门静脉注射接种HCV，观察到有60%(12/20)树鼩出现一过性的类似肝炎的症状，丙氨酸转氨酶指标升高，最高可达到192 U/L；在肝组织中能检测到HCV RNA抗原，感染树鼩后的病毒载量最高时可达到1×105copies/mL，肝脏活体组织病理检查发现不同程度的肝炎症状。以上的实验结果均提示树鼩可以成为丙型肝炎的小动物感染模型。

2.3HCV体外感染树鼩模型赵西平等[17]采用HCV RNA阳性患者的血清感染树鼩原代肝细胞，结果显示树鼩肝细胞和感染后的上清液均可检出HCV RNA，且感染后的上清液可传代感染新的肝细胞，证明HCV已经成功感染树鼩肝细胞。Guitart等[18]研究发现，HCV可以在肝细胞直接激活核因子κB通路，在HCV感染树鼩原代肝细胞最初的24 h内，是通过上调核因子κB相关基因趋化因子的作用来实现的。HCV准种能快速适应机体特定的生物学环境产生变异，HCV刺激干扰素反应迟钝而诱发炎症感染树鼩肝细胞。有学者用HCV RNA阳性血清感染树鼩肝细胞，感染后第5～17日，细胞内可检出HCV正负链RNA；在电镜下观察到体外感染细胞的胞质内含有大量的脂肪空泡、疑似病毒样结构，证实了HCV在体外能感染树鼩原代肝细胞，而且能直接致肝细胞损伤病变；然而用HCV阳性的血清孵育大鼠肝细胞后却检测不到HCV RNA，说明HCV病毒感染宿主细胞具有种属特异性，证明了树鼩与灵长类动物的亲缘关系，为树鼩成为丙型肝炎动物模型提供了依据[19-20]。目前的研究表明，使用HCV阳性的人血清尚不能建立高效的、重复性好的感染。最好的解决方法是使用可重复性好、感染性高的细胞培养HCV代替患者血清来研究丙型肝炎动物模型。Wakita等[21]在爆发型HCV患者的血中发现毒力强的基因型2a的HCV病毒株JFH-1，在Huh-7细胞系中可进行大量的复制，将细胞培养体系的上清液感染黑猩猩，显示血样和上清中能持续检测到JFH-1株，证实HCV可以通过细胞培养体系产生。童一民[22]用HCV假病毒和细胞培养产生的HCV感染树鼩原代肝细胞，发现均能发生感染，并且细胞培养产生的HCV感染树鼩肝细胞能完成完整的病毒复制过程,产生感染性HCV颗粒；细胞培养产生的HCV(J6/JFH1)还能体内感染树鼩，发现感染的6只中,有2只血清中能间歇性检测到HCV RNA，说明树鼩可能作为HCV小动物感染模型。Tong等[23]用嵌合病毒J6/JFH1感染树鼩原代肝细胞,用反转录-聚合酶链反应测定感染细胞培养上清中新产生的HCV载量,观察的8 d时间里维持在一个较低的相对稳定的水平(103～104.5copies/mL),在转染的第6日达到最大值，证实了树鼩原代肝细胞可以支持HCV感染。李尧[24]用J6/JFH-1HCV(病毒载量为107U/mL以上)感染表达人CD81分子的树鼩原代肝细胞,检测到第7日最高病毒载量的值为106U/mL，证实了J6/JFH-1HCV病毒株可成功感染树鼩,并有利于研究HCV感染和复制的机制。

3其他丙型肝炎动物模型

3.1黑猩猩黑猩猩基因组约98%与人类相同，且黑猩猩是目前唯一被肯定的HCV易患动物,可以感染HCV流行病学重要的6个基因型,感染病毒后先天和适应性免疫反应均类似于人类；但使用黑猩猩作为实验动物的费用很高,动物来源极为有限，且和人类为“近亲”的伦理道德，严重阻碍了黑猩猩作为丙型肝炎动物模型[25]。

3.2小鼠近年来,小鼠模型应用最广泛。自然状态下小鼠HCV感染率极低，通过改造后感染成功率明显增加。有学者开发了一种嵌合重症联合免疫缺陷/尿激酶型纤溶酶原激活小鼠模型，这种免疫缺陷小鼠模型支持移植的人肝细胞增殖，持续HCV感染如静脉内接种后小鼠血浆中可检测到HCV RNA并出现与人相似的毒血症状，证实了人肝细胞占嵌合小鼠肝体积的大部分(至少80%)可发生HCV感染并可能导致肝衰竭[26-27]。但由于严重的联合免疫缺陷，因此不能被用于适应性免疫应答的研究或对疫苗的评价。Washburn等[28]提出了一种小鼠模型，即人源化的小鼠显示出同时具备人肝细胞和免疫细胞，感染HCV后小鼠肝脏中可检测到HCV RNA；最后约50%的人源化小鼠肝脏出现炎性变化和肝纤维化，该种小鼠缺乏完整免疫系统，其免疫应答有限，其血清中测不到HCV RNA，不能支持HCV的高效复制。Dorner等[29]开发了一种人源化的小鼠模型，其表达HCV特异性感染受体(包括CD81、紧密连接蛋白、SR-B1和Cluandin-1)，该模型证明了特异性CD81和Occludin是HCV进入小鼠肝细胞必不可少的。因为这个模型中使用的是免疫小鼠，阻碍了病毒复制和感染的研究。

4小结

目前研究已经证实，无论是体内还是体外的实验研究结果都初步显示树鼩能感染HCV，因此树鼩有可能成为除人和黑猩猩以外能感染HCV的可靠小动物品系。 虽然目前丙型肝炎树鼩模型还不够稳定，感染率低、重复性差，但树鼩的亲缘关系接近于灵长类，比小鼠更适合于HCV感染的研究，并且我国树鼩资源丰富，应该大力发展并最终建立可行的树鼩丙型肝炎模型，这将有助于丙型肝炎疫苗的研发和抗丙型肝炎药物的筛选，以便进一步更好探讨HCV感染与复制的机制。

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Research Progress in Tupaia Animal Model of Hepatitis CZHOULing-li1,2,YANGChun1,CAOJi1.(1.ResearchDepartmentofGuangxiCancerInstitute,Nanning530021,China； 2.GraduateSchoolofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:Hepatitis C virus(HCV) infection is one of the serious public health problems concerned all over the world.Only through establishing a stable and reliable model of HCV infection can better study in chronic HCV infection and carcinogenic mechanism be realized,thus to promote the development of hepatitis C vaccines and anti-HCV drugs.HCV has a particularly narrow host range,only humans and chimpanzees are susceptible to it.There are some in vivo and in vitro experiment results preliminarily showing that tupaia is currently the animal besides the chimpanzee which can be infected with HCV.Here is to make a review of the research progress in tupaia animal model of HCV infection.

Key words:Hepatitis C virus; Tupaia; Animal models

收稿日期：2014-08-15修回日期：2014-11-18编辑：郑雪

基金项目：国家自然科学基金(81260080)；广西自然科学基金(2013GXNSFAA019210)；广西科技基础条件平台建设项目(10-108-25)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.004

中图分类号：R332； R373.21

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)11-1930-03