多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用

孙春琼　沭阳南关医院检验科，江苏省沭阳县　223600



多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用

孙春琼沭阳南关医院检验科，江苏省沭阳县223600

摘要目的：探究多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用。方法：分析Genbank数据库的基因序列，针对保守区分别设计并合成两对特异性引物(P1/P2，P3/P4)。通过对扩增条件的优化，建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法。结果：合适引物浓度为P1/P2为0.32μmol/L，P3/P4为0.96μmol/L。双重检测的最小病毒核酸量为2ng/μl，H5N1病原体混合液在相对应位置出现特异性条带，而其他病毒及空白对照均未出现条带。结论：多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体具有敏感性高、特异性强等优点，对于禽流感的预防和控制具有积极的作用。

关键词逆转录聚合酶链式反应H5N1病原体探针引物

禽流感由于其高致病性曾经给养禽业带来致命的打击，有些禽流感甚至可以直接传染给人。近年来禽流感又反复出现，引起了相关部门的广泛关注，也成为了当前研究的热点。其中，H5N1传染性强，为卫生部新传染病防治法中规定报告的法定传染病，可以通过人畜传播，具有较强的致病性。目前，国际上比较常用的检测禽流感病毒的方法为鸡胚病毒分离法，但是由于检测过程比较繁琐，耗费较长的时间和精力，不适合用于大型的传染病检测[1]。近年来，随着分子生物技术的不断发展，为检验及诊断学带来了很多便利。其中RT-PCR检测由于其定量准确、特异性强、敏感度高等优点，为H5N1病原体的检测带来了很多便利。本文主要阐述了多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用，具体报道如下。

1材料与方法

1.1实验样本收集2014年1月H5N1禽流感暴发流行期间的H5N1病毒株，在实验室内进行分离，提取H5N1亚型标准抗原并进行保存。

1.2试剂和仪器QIAamp病毒RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，SARS-CoY RNA荧光定量聚合酶链反应法试剂盒、禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR检测试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，鼠源逆转录酶、Taq酶、RNA酶抑制剂、dNTP购自Promega公司。分子生物学软件选择DNAstar 10.0版本，primer 10.0版本。仪器选择PE 9600PCR仪、uglltcycler荧光PcR检测仪。

1.3实验方法

1.3.1RNA的抽提：采取标本，立即进行前处理，使用QIAamp病毒RNA提取试剂盒(产自德国QIAGEN公司)抽提禽流感病毒RNA。严格按照试剂盒说明书进行操作，以H5N1病原体RNA为模板，P1/P2为引物进行RT-PCR，反应结束后用15g/dl的琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR产物。反应条件为:42℃40min，94℃4min，然后94℃35s，42℃35s，72℃35s，35个循环，最后72℃延伸8min[2]。

1.3.2引物设计：参照GenBank数据库中已注册的禽流感病毒H5N1亚型毒株的基因核苷酸序列，用primer10.0版本软件设计多对引物P1/P2和P3/P4，同源性分析采用DNAstar10.0版本生物软件进行比较，理论跨幅为290bp和320bp[3]，引物及探针序列如下(由上海生工生物工程有限公司提供)。引物序列(5’端用生物素标记)：上游：5’-TATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAG-3’(25bp)；下游：5’-GCAAATTCTGCATTGTAACGATCC-3’(24bp)；探针序列为：5’-GCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCT-3’。

1.3.3PCR检测：选取最佳引物浓度，以上述反转录产物为模板，进行PCR敏感性实验，具体操作如下：94℃3min，然后进入循环94℃30s，54℃30s，72℃30s，30个循环，于72℃延伸10min，4℃保存。用10g/dl琼脂糖凝胶电泳检测，取5μl PCR产物与6×Loading buffer 1μl混匀，点样，100～120V电泳30min，在紫外灯下观察扩增片段判断结果[4]。

2结果

2.1确定引物浓度本次共实施5组实验，P1/P2的引物浓度分别为0.32、0.48、0.64、0.80、0.96μmol/L。P3/P4引物浓度分别为0.32、0.48、0.64、0.80、0.96μmol/L。经过检测实验，合适的引物浓度为P1/P2 0.32μmol/L，P3/P4 0.96μmol/L。进行PCR反应体系扩增，测序结果与GenBank数据库中已注册的两种禽流感病毒的基因核苷酸序列进行比较，同源性达98%以上。

2.2特异性与敏感性检测经测定10-4病毒液的RNA浓度为2ng/μl，因此该方法可检测的最小病毒核酸量为2ng/μl。根据双重PCR分析，H5N1病原体混合液均在相应位置出现两条特异性条带，其他病毒及空白对照均未出现条带，特异性明显。P1/P2和P3/P4二联检测10倍梯度稀释的单项模板，P1/P2和P3/P4的敏感度都为10-4，与单项RT-PCR敏感性相同。

3讨论

禽流感是一种烈性传染病，是当今世界人类面临的最严重的健康威胁之一，它能引起动物及人类传染急性呼吸系统疾病，被国际兽疫局确定为Ⅰ类烈性传染病，世界卫生专家曾多次强调加强禽流感病毒的防控及研究对于动物和人类健康具有重要的意义。由于禽流感病毒血清型较多，且容易发生变异，因此寻找一种快速、准确的检测禽流感病毒，尤其是具有高致病性的H5N1亚型病毒的方法至关重要。

禽流感病毒的检测一般需要依靠实验室检查，其中病毒的分离鉴定是最终确诊的主要依据，实验室检查虽然准确度较高，但耗时较长、操作繁琐，需要专业人员才能完成，不适合用于大规模的临床检测，此外，血清学检测也是临床上一种常用的诊断技术，但是其特异性及敏感性有限，用于检测H5N1病毒具有一定的局限性。近年来分子生物学技术发展迅速，已被大量用于禽流感病毒的检测，其中主要的检测方法有聚合酶链反应、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和荧光RT-PCR、核酸分子杂交、基因探针技术、ELISA等方法。RT-PCR是近年来发展的一种较为成熟的体外基因扩增技术，具有准确、快速、简单的优点，已经成功的用于多种病毒的基因检测。

目前关于H5N1亚型病毒的研究越来越多，Chen等对来自我国南方地区的21株宿主为鸭的H5N1禽流感病毒进行了分离和全基因组测序，并与Genbank中的某些病毒株一起构建了系统发育树，用于相关基因的进化研究[5]。本文结果显示，合适的引物浓度为P1/P2 0.32μmol/L，P3/P4 0.96μmol/L，PCR反应体系扩增后基因测序结果与GenBank数据库中已知的基因核苷酸序列进行比较，同源性达98%以上。P1/P2和P3/P4二联检测10倍梯度稀释的单项模板，P1/P2和P3/P4的敏感度都为10-4，与单项RT-PCR敏感性相同。就检测敏感性与特异性而言，在理想状态下，只要退火温度足够低，能够保证引物同目的序列有效退火，就可以减少检测过程中的非特异性结合，提高检测的特异性，而根据双重PCR的分析结果恰恰证明了这一点，H5N1病原体混合液均在相应位置出现两条特异性条带，而其他病毒及空白对照均未出现条带。就敏感性而言，在多种探针的应用中，多重PCR引物检测的敏感性几乎接近单重PCR水平，敏感性较高。此外，多重PCR引物可以用于成组病原体的检测，但是引物浓度是关键，只要选择合适的引物浓度，多个PCR中不同的引物就可以在同一反应体系中进行特异性扩增，在同一个PCR反应中就可以同时检测多种病原体，节省时间，提高检测效率。

目前，RT-PCR技术已经成功应用于医学研究、流行病分子生物学等多个领域，也为临床诊断提供了新的思路。

RT-PCR技术具有针对性强、检测周期短、特异性高等优点，可以有效的检测出H5N1病毒，对于禽流感的预防和控制具有积极的作用，值得在临床进一步推广应用。

参考文献

[1]彭宜，谢芝勋，等．H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立〔J〕.中国人畜共患病学报，2011,27(1)：19，22．

[2]孙阳,沈银忠.新型禽流感：H7N9〔J〕.检验医学,2013,28(9):739.

[3]Jiang T，Kang XP，Deng YQ，etal．Development of areal time RT-PCR assay for anovel influenza A(H1N1)virus〔J〕.Journal of virological Methods,2010，163(2):470-473.

[4]娄国平,李显东,等.多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用〔J〕.现代检验医学杂志,2014，29(5):73-75.

[5]钟静,黄平,等.广东两株人禽流感H5N1毒株节段基因及蛋白特征和进化分析〔J〕. 中华传染病杂志，2011,29(3):171.

(编辑雅文)

收稿日期2015-02-12

中图分类号：R446.5

文献标识码：B

文章编号：1001-7585(2015)18-2527-03