低氧诱导因子对软骨细胞的作用

胡伟全综述，张 雷，赵建宁审校

0 引 言

关节软骨缺乏血管，其氧与营养物质只能从关节滑液及软骨下骨中获得。正常情况下，关节滑液及软骨细胞含氧量较低，在软骨深层，氧含量可以降低至1%，当出现骨关节炎等病变时，关节滑液中的含氧量将进一步降低［1］。由于关节软骨不同程度的暴露于低氧环境中，氧分压直接影响关节软骨的代谢及生长发育。体外培养下，当氧分压发生改变时，不同层次不同表型的软骨细胞特异标志物亦发生改变［2］。低氧诱导因子(hypoxia inducible factors，HIFs)是关节软骨细胞适应低氧环境的重要细胞因子，研究HIFs 有助于了解软骨损伤的发生机制及为软骨损伤修复提供理论指导。HIFs 包括HIF-1、HIF-2 和HIF-3 等3 种亚型，目前主要研究HIF-1、HIF-2 对于软骨细胞的作用。现就HIFs 对关节软骨的代谢及生长发育的进展作一综述。

1 HIFs 对软骨细胞代谢的作用

Ⅱ型胶原和蛋白多糖是软骨基质的主要组成成分。正常情况下，软骨基质的合成与分解处于动态平衡中，当Ⅱ型胶原蛋白，蛋白聚糖等合成增加时，软骨缺损将得以修复，当基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinases 3，MMP3)等合成增加时，软骨分解代谢增强，进而损伤软骨组织。既往研究表明哺乳动物软骨细胞内线粒体数量稀少，耗氧量主要是通过糖酵解获取能量，而HIFs 是关节软骨细胞适应低氧环境的重要细胞因子，这表明HIFs 可能在软骨细胞代谢中发挥重要作用。现研究主要针对Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖、MMP3 等进行检测，进而了解HIFs 对软骨代谢的作用。

1.1 HIFs 可以促进软骨细胞合成代谢 体外培养关节软骨细胞时，与20%氧浓度的常氧环境相比，2%氧浓度环境中，HIF-1α、HIF-2α 早期明显升高，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、硫酸化黏多糖合成增加，同时X 型胶原、Ⅰ型胶原、MMP1、MMP2、MMP3、MMP13 合成下降，所以低氧可以通过HIF-1α、HIF-2α 促进细胞外基质合成，同时降低退变相关酶的基因表达［3］。进一步研究表明HIFs 促进软骨细胞合成代谢是通过直接作用于SOX9 的启动子，进而促进Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等合成增加，且HIFs 与Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等的合成存在剂量正相关效应［4］。

1.2 HIFs 可以抑制软骨细胞合成代谢 低氧环境亦可能抑制软骨细胞的合成代谢，从而损伤软骨。浅表层蛋白和蛋白多糖4 是关节软骨润滑液的重要组成成分，由关节软骨的表层软骨细胞和滑膜细胞分泌，在减少软骨与软骨面的摩擦，保护软骨方面起着重要作用，增强关节软骨的润滑剂分泌可能有益于减缓骨关节炎的进展。将牛关节软骨细胞分别培养于21%，5%和1%的氧浓度中，显示5%和1%氧浓度的浅表层蛋白和蛋白多糖4 分泌较21%氧浓度明显降低，但当HIF-1α 基因沉默时，浅表层蛋白和蛋白多糖4 基因表达在不同氧浓度下无明显改变，所以低氧可能激活HIF-1α，继而抑制浅表层蛋白和蛋白多糖4 的产生［5］。

1.3 HIFs 可以促进软骨细胞分解代谢 关节软骨细胞不同程度暴露于低氧环境中，低氧环境除了影响关节软骨的合成代谢外，同样可以影响关节软骨细胞的分解代谢。将关节软骨细胞培养于低氧环境中，同时对分解代谢相关介质进行检测，发现在低氧环境中，HIF-1α、HIF-2α 和分解代谢相关介质如:白细胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α、MMP-3、MMP-13 及氧自由基表达均明显升高［6-7］。当将编码HIF-2α 的腺病毒直接转染关节软骨细胞或在具有编码Epas1 的转基因老鼠体内，MMP-3、MMP-12 和MMP-13 的表达亦明显增加［8-9］。

目前研究表明，HIFs 对关节软骨的综合代谢作用的影响尚不明确，不同实验得出的结论不一致。HIFs 尽管在结构及调控机制具有相似之处，但其对病理、生理状态下的关节软骨作用不尽相同。HIFs对关节软骨的代谢作用的不确定或许是不同HIFs亚型共同作用的结果。明确各HIFs 亚型对关节软骨细胞亚型的作用，有助于选择性的利用HIFs 促进软骨合成代谢，抑制分解代谢，促进软骨愈合。

2 HIFs 对软骨修复的作用

关节软骨位于长骨两端，它可以分散关节面的压力负荷、减轻震荡、降低关节面摩擦系数，但由于其自身修复能力有限，一旦关节软骨破坏，常造成关节软骨永久性损伤。组织工程用于软骨修复是目前的研究热点［10-11］。考虑关节腔处于一种低氧环境中，HIFs 有可能对于软骨的生存及修复发挥重要作用。既往研究也表明，在HIF-1α 缺乏的情况下，可见大量软骨细胞死亡，而低氧环境可以促进软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原蛋白合成增加［12-13］。研究HIFs对软骨修复的作用并用于组织工程修复软骨是当前的研究重点。

将人骨髓间充质干(bone mesenchylmal stem cells，BMSCs)细胞培养于低氧或过度表达HIF-1α的环境中，Ⅱ型胶原蛋白，蛋白聚糖的基因表达及蛋白合成均明显增加，而X 型胶原的合成明显减少。当HIF-1α 功能被阻断时，X 型胶原的合成明显增加而Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖、SOX9 的基因表达明显下降。进一步将经HIF-1α 诱导的人BMSCs 经皮植入无胸腺小鼠体内时，可见明显透明软骨样基质产生。所以在低氧环境中，HIF-1α 可能刺激SOX9 表达，从而促进软骨源性相关标记物合成［14］。低氧除了可以促进细胞基质合成外，亦可以通过HIF-1α或HIF-2α 作用于间充质干细胞(mesenchylmal stem cells，MSCs)，促进MSCs 增殖并向软骨分化，同时抑制其成脂、成骨分化能力［15-17］。低氧也可以通过HIFs 作用软骨细胞，促进软骨形成或抑制软骨组织损伤。将正常软骨细胞培养于低氧环境中，发现在低氧环境中，HIF-2α 可以直接或间接作用于SOX9，进而诱导软骨组织产生，同时HIF-1α 可以抑制软骨组织自发性或诱导性损伤［18-19］。

尽管HIFs 对关节软骨代谢的作用尚不明确，但目前研究倾向于认为在低氧环境中，HIFs 可以促进软骨修复。

3 HIFs 对软骨内成骨的作用

随着病程发展，骨关节晚期患者常表现为软骨硬化、增生、骨赘形成。考虑关节软骨细胞属于低氧感应细胞，HIFs 可能在软骨内成骨中扮演重要作用。

当抑制HIF-1α 表达，软骨内成骨及软骨细胞增殖相关的重要生长因子如骨形态蛋白2 表达受到抑制，在缺乏HIF-2α 时，软骨内成骨亦暂时性的延缓。进一步研究表明，HIF-2α 很可能通过诱导C/EBPb表达而发挥作用［20-22］。血管生成可以为软骨内骨形成提供氧、营养物质和成骨细胞，是软骨内成骨的重要标志，而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前公认最强的促血管形成因子，检测关节软骨细胞中HIFs 与VEGF 蛋白表达，有助于了解HIFs 在骨关节炎发病中的作用。实验研究证明，在低氧环境中，HIF-1α 表现为持续升高，而VEGF 在第12 小时达到高峰［23］。当抑制HIF-1α功能时，VEGF 表达也受到抑制，因而作者认为低氧可能通过HIF-1α 促进VEGF 表达［24］。

成骨细胞活性在关节软骨内成骨中亦非常重要，HIFs 在实验中证实可以促进VEGF 表达，同时也证明其可以抑制成骨细胞活性。在低氧环境下，成骨细胞中Wnt 信号通路拮抗剂硬化蛋白(sclerostin，Sost)表达升高，当加入HIF-1α 激活剂去铁敏时，Sost 表达进一步增加，而HIF-1α 表达受到抑制时，成骨细胞中Sost 表达下降，这表明HIF-1α 可以通过激活Sost 抑制成骨细胞活性，从而抑制软骨内成骨［25］。

HIFs 既表现为促进VEGF 表达，继而促进关节软骨内成骨;亦表现为抑制成骨细胞活性，继而抑制关节软骨内成骨。其在软骨内成骨的不同阶段作用不一，在骨关节炎不同时期的作用亦可能并不一致。继续研究HIFs 在不同低氧浓度、不同时期对关节软骨内成骨的作用，抑制血管形成、成骨细胞活性，有助于延缓骨关节炎的发展。

4 HIFs 对软骨细胞凋亡的影响

软骨细胞凋亡是骨关节炎发病机制的重要环节之一，减少软骨细胞凋亡可能有助于减缓骨关节炎的进展。实验室研究表明，不同的HIFs 亚型对软骨细胞凋亡的影响不一。在低氧环境中，HIF-1α 可以促进热休克蛋白70 表达升高，也可以通过避免DNA 损伤，继而促进细胞外基质合成增加和提高细胞生存能力，保护细胞免于凋亡，但当HIF-1α 功能受到抑制时，该作用被明显抑制［26-27］。在骨关节炎时，炎症介质如IL-1b 等升高，亦可以促使HIF-1α表达升高，表达在骨关节时，HIF-1α 对软骨细胞具有保护作用［28］。而当软骨细胞中HIF-2α 升高时，软骨细胞的凋亡明显增加。但单纯HIF-2α 过度表达或敲出HIF-2α 基因并不会出现明显的细胞凋亡，当出现抗Fas 抗体时，HIF-2α 可以明显促进软骨细胞凋亡。在动物实验中，关节腔内注射负载Epas-1的慢病毒或在表达HIF-2α 的转基因小鼠中，可见明显软骨细胞凋亡及软骨破坏，当Epas-1 基因敲除后，软骨细胞凋亡及软骨破坏明显较少，而且在Fas基因缺失的小鼠关节腔内注射负载Epas-1 的慢病毒，亦无明显的软骨细胞凋亡及软骨破坏表型，所以HIF-2α 可以加强Fas 介导的软骨细胞凋亡及软骨破坏［29］。

HIF-1α 在低氧环境中可以抑制软骨细胞凋亡，而HIF-2α 在低氧环境中却可以促进软骨细胞凋亡，表明不同HIFs 亚型在低氧环境中对软骨细胞凋亡的作用不一致，进一步研究各HIFs 亚型对软骨细胞的作用，选择性的利用HIFs 抑制软骨细胞凋亡有助于延缓软骨退变，延缓骨关节的发生。

5 展 望

由于缺乏血管，软骨损伤后自行修复能力有限，寻找有效的软骨修复方法是医学界研究的热点。关节软骨在关节腔内受多种因素影响，在低氧环境中，HIFs 对关节软骨的新陈代谢、生长凋亡等均有重要作用。如今随着对HIFs 研究的进展，HIFs 关节软骨的新陈代谢、生长凋亡等的作用也越来越清晰，但HIFs 对软骨的作用还有待于进一步探索:①在不同的氧浓度下，不同层次的软骨细胞对氧浓度的反应不一，因此应探索适当的氧浓度用于促进不同层次的软骨修复;②软骨修复是受多种因素影响的复杂过程，应进一步研究低氧诱导因子与其他生长因子联合使用促进软骨修复;③不同低氧诱导因子亚型在低氧环境中对软骨细胞的作用不同，应进一步探索各亚型在软骨修复中的作用;④HIFs 在骨关节炎的不同时期作用亦可能不一致，在疾病发生的各期应选择性的利用HIFs 各亚型用于延缓骨关节炎的发展;⑤当饮食结构发生转变时，体内HIF-1α 表达亦发生转变，或许将来可以通过改变饮食或口服药物调控人体内HIFs 的表达，促进软骨修复，延缓关节炎的发展［30］。展望未来，随着不同氧浓度、各低氧诱导因子亚型及联合使用各种生长因子在软骨修复中的作用越来越清晰，这将给组织工程临床修复软骨带来新的希望。

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