微RNA在胰腺癌诊断及治疗中的研究进展

叶秋文，甘　平(综述)，谭　晶(审校)

(昆明医科大学第三附属医院 云南省肿瘤医院腹部外科，昆明 650118)



微RNA在胰腺癌诊断及治疗中的研究进展

叶秋文△，甘平(综述)，谭晶※(审校)

(昆明医科大学第三附属医院 云南省肿瘤医院腹部外科，昆明 650118)

摘要：胰腺癌是常见的恶性程度较高的消化道肿瘤，除手术切除外缺少有效的治疗手段，患者5年内生存率<5%。微RNA(miRNAs)家族在分子层面影响着RNA-RNA的相互作用，miRNA在转录后水平对细胞的代谢、生长、分化、增殖、凋亡发挥着重要作用，这种对细胞的作用同样存在于肿瘤细胞中。近几年来已发现20种以上的miRNAs，在胰腺癌的生物学行为、发生发展、转移以及化疗的敏感性中的表达存在差异。

关键词：胰腺癌；微RNA；诊断；治疗

胰腺癌是一种常见的消化系统肿瘤，恶性程度高，早期诊断困难，一般诊断时已是晚期。其局部侵犯，早期转移，对放化疗不敏感，预后差，病死率高，治愈率低是胰腺癌的主要特点。在西方国家，胰腺癌的病死率居于第4位[1]，据美国2011年的统计，胰腺癌的发病率为44 030例/年， 37 660例患者死亡[2]。在中国肿瘤登记地区胰腺癌的发病占全部癌的2.64%，位居第7位，死亡占全部癌症4.04%，位居第6位[3]。近年来国内外胰腺癌的发病率均成上升趋势，但目前的治疗主要以手术为主，放化疗效果不令人满意，缺少有效的治疗手段，患者5年内生存率仍<5%[4]。1997年吉西他滨被美国食品药品管理局[5]认证作为治疗胰腺癌的一线化疗药物，但其对胰腺癌的抑制并不理想。随着分子生物学等学科的发展，基因在肿瘤中的作用也逐渐被肯定，分子水平上通过对肿瘤靶基因的沉默从而抑制肿瘤的生长已成为研究的热点。微RNA(microRNA,RNA)被证实在许多肿瘤中参与了肿瘤的生物调控作用，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌等，这种miRNA间接地发挥着抑癌基因和致癌基因的作用[6]。现就目前对胰腺癌的诊断和治疗中涉及miRNA的研究进行综述，希望对胰腺癌未来的诊断和治疗提供帮助。

1miRNA的形成与作用

miRNA是一种小的内源性非编码RNA分子。首先，RNA聚合酶Ⅱ及RNA聚合酶Ⅲ启动子指导miRNA基因转录成初级转录产物(pri-miRNA)，动物pri-miRNA第一次剪切位于细胞核内，由核内的核糖核酸酶-Ⅲ Dorsha/DGCR8复合体(RNase-ⅢDorsha/DGCR8)将pri-miRNA剪切成由60～70个核苷酸组成的具有发夹结构的miRNA前体(pre-miRNA)[7]。其3′端具有2nt的突出臂与Ran-GTP依赖性核浆转运子Exprotin5(Exp5)结合，从核内转移至胞质[8-9]，由另一种RNase-Ⅲ酶Dicer将pre-miRNA剪切成为由21～25个核苷酸组成的不完全配对的双链RNA双体，即成熟miRNA和其互补序列所组成的二聚体。成熟miRNA整合入RNA-蛋白复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)后形成miRISC复合物(miRNA-蛋白复合物)，miRISC与靶信使RNA结合发挥降解作用，使信使RNA翻译抑制，在转录后水平对细胞的代谢、生长、分化、增殖和凋亡起重要作用[10]。

2miRNA与胰腺癌的诊断

2.1胰腺癌组织中的miRNA目前，公认的与胰腺癌联系最紧密的miRNA是miR-21，Dillhoff等[11]对80例胰腺癌患者的研究将miR-21在胰腺中的表达分为强阳性、弱阳性和阴性，miR-21阳性表达的患者63例，阳性率为79%，其中14例患者miR-21有强阳性超表达；对照组12例正常胰腺组织中有1例miR-21阳性表达，阳性率为8%(P<0.0001)；45例慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)患者中有12例miR-21阳性表达，阳性率为27%(P<0.0001)，强阳性表达只存在于肿瘤中，慢性胰腺眼和正常胰腺阳性表达仅为弱阳性，提示miR-21 的检测可以区别肿瘤的良恶性的敏感指标。

郑岩松等[12]利用miRNA芯片技术比较胰腺癌组织和癌旁正常胰腺组织的miRNA表达差异，用实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)验证得到，与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中表达上调超过1.5倍的miRNA有15个，miR-10a、miR-12、miR-106a、miR-21、miR-199a-5p、miR-34a、miR-143、miR-222、miR-23b、miR-221、miR-17、miR-196a、miR-29b、miR-181d、let-7a；旨在对microRNA谱的测定，为诊断胰腺癌提供更多可用指标。

Szafranska等[13]通过对胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)及正常胰腺组织和CP组织中190种microRNA的分析，发现PDAC中41种miRNA下调(主要是miR-216、miR-217)，32种miRNA上调(主要是miR-155、miR-146、miR-221、miR-223)。同时还指出，miR-18a、miR-31、miR-93、miR-221、miR-224仅在PDAC细胞株中表达，可能是早期PDAC潜在的生物学标志物。

某些microRNA在胰腺癌中低表达，扮演着胰腺癌中抑癌基因的角色。Lee等[14]对体外两个细胞株MiaPACA-2和PANC-1的研究中发现miR-107低表达，通过增强miR-107的表达，细胞株的体外生长受到抑制，其他4个microRNA(miR-29a、miR-29b、miR-103、miR-320)通过甲基化CPG岛的方式抑制细胞株的生长。郑岩松等[12]对miRNA谱的测定也显示，表达下调超过1.5倍的microRNA有11个，即miR-107、miR-130b、miR-516b、miR-637、miR-5481、miR-375、miR-516b、miR-431、miR-5481、miR-622、let-7d*。

对这些在胰腺癌中低表达的microRNA的研究，可能对临床提供更多早期诊断胰腺癌的新指标，也可成为基因治疗胰腺癌的新靶点，通过刺激这些microRNA的表达，抑制胰腺癌的生长。

2.2胰腺癌血清学miRNA的检测目前临床上应用的胰腺癌肿瘤标志物是癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)与 糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)，虽然这两个指标对检测肿瘤有一定的帮助，但是对胰腺癌的检测缺乏较好的特异性与敏感性，因此能开发出一种特异性及敏感性高的生化检测指标是胰腺癌能早期诊断、正确诊断的必经之路，最近许多研究发现，在胰腺癌的血清学改变中加以对miRNA的检测，能对胰腺癌的诊断提供更好的诊断基础。

Kong等[15]利用实时PCR的方法对35例PDAC志愿者及15例CP患者、15例正常人的血清miRNA进行检测，结果发现miR-21在PDAC组的血清中高表达，miR-21能鉴别CP组和正常人组；miR-155和miR-196a在PDAC组和CP组高表达，能对PDAC组和CP组与正常人组进行鉴别；还发现miR-196a 可能是一个潜在提示胰腺癌患者的预后的生物学指标，TNM分期在Ⅲ~Ⅳ期的胰腺癌患者中miR-196a的表达水平高于分期在Ⅰ~Ⅱ期的胰腺癌患者，而且对PDAC患者跟踪调查，排除miR-196a升高的CP患者，miR-196a高表达的PDAC患者平均存活时间为6.1个月，miR-196a低表达的PDAC患者平均存活时间为12个月。

Liu等[16]利用实时PCR技术对140例胰腺癌患者(PC组)，111例CP患者(CP组)和68例正常人(正常组)血清中的RNA进行检测，对比这些人血清中的CA19-9及miRNAs进行分析，发现7个miRNA(miR-16、miR-21、miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-196a、miR-210)的表达在PC组显著增高，与在CP组和正常组的表达差异有统计学意义，其中miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-196a在CP组高表达，与正常组的表达差异有统计学意义(P<0.005)；其中，miR-16、miR-196a在鉴别胰腺肿瘤与非肿瘤疾病中发挥着重要作用，联合血清CA19-9对胰腺癌组(PC组)与非胰腺癌组(CP+正常组)的鉴别诊断的灵敏度为92%、特异度为95.6%，PC组与CP组的鉴别诊断灵敏度为88.4%、特异度为96.3%。这可能对胰腺癌的早期诊断提供更准确的生物学指标。

上述对胰腺癌血清学及组织学miRNA检测的研究都提到胰腺癌患者升高的miRNA，尤其是miR-16、miR-21、miR-155、miR-196a等，在胰腺癌的早期诊断与鉴别诊断甚至预后评估中发挥重要作用。胰腺癌胰液中表达的miRNA也有研究报道[17]，但胰液的获取比较困难，使胰液检查受到了局限。如果能更深地研究miRNA的基因谱，发现更多胰腺癌患者血清中上调和下调的miRNA与CA19-9联合，旨在对胰腺癌早期的血液生化改变进行更准确的诊断。

3miRNA与胰腺癌的治疗

3.1miRNA-胰腺癌靶向治疗的新靶点现阶段认为胰腺癌发生、发展关系密切的原癌基因包括K-ras基因、HER2/neu基因、丝/苏氨酸激酶2基因、EGFR基因等，其中K-ras基因被认为是与胰腺癌关系最密切的[18]。K-ras基因编码的p21蛋白石膜相关G蛋白，通过与细胞膜上酪氨酸激酶受体结合调节细胞的增殖和分化。针对miRNA的靶向治疗是一种新的治疗方法，可以通过miRNA的再表达或抑制表达来抑制胰腺癌原癌基因的表达。Pramanik等[19]认为miR-34a是p53基因转录信使RNA的组成部分并能调节肿瘤干细胞的生存，miR-34a和miR-143/145复合体联合能抑制K-ras2及其效应蛋白RREB1的表达，从而抑制胰腺癌的增殖和增加胰腺癌的凋亡。Zhao等[20]对4个PDAC细胞株(PANC-1、MIAPaCa-2、AsPC-1、BxPC-3)及人PDAC标本进行研究，认为miR-217 是K-ras基因的1个靶点，上调miR-217能减少K-ras基因的蛋白水平和减少丝/苏氨酸激酶的磷酸化水平，miR-217可以作为miRNA治疗PDAC的一个新靶点。Nalls等[21]在对以5-Aza-dC 和SAHA治疗的人类胰腺癌细胞株的研究中也证明miR-34a在胰腺癌肿瘤干细胞中的再表达很强地抑制肿瘤细胞的代谢、生长、分化、增殖，以及肿瘤的侵袭与间质转化，在胰腺癌的肿瘤干细胞中，miR-34a通过激活caspase-3/7来诱导肿瘤细胞凋亡。由此可见miR-34a在胰腺癌的miRNA靶向治疗中越来越被认可，miR-217和miR-143/145复合体等新靶点的发现也为胰腺癌miRNA靶向治疗提供了更多依据，也可联合胰腺癌中已被熟知的miR-21[22]、miR-155[17]等设计成miRNA治疗中同时被抑制的靶点。

3.2miRNA与胰腺癌的耐药性目前根治性手术切除仍是目前胰腺癌患者获得长期生存的唯一方法，胰腺癌的早期诊断是根治性手术的基础，术后进行放化疗[23]。单独利用miRNA进行胰腺癌的靶向治疗还在临床试验中，许多研究报道胰腺癌化疗药物的耐药和不敏感与胰腺癌生长中某些miRNA的表达有关。LaConti等[24]证明了血清中miR-10与miR-155的表达水平与吉西他滨的敏感性与耐药性有关，建议化疗前检测血清中这两个miRNA的水平，不同的miRNA表达水平化疗效果不同。Preis等[25]通过对PDAC的标本分析，发现miR-10b在PDAC标本中超高表达，而且证明了miR-10b的过度表达降低了吉西他滨新辅助化疗的敏感性，miR-10b低表达的患者对吉西他滨化疗敏感，手术后存活时间长，并推断miR-10b是诊断PDAC的一个新生物学指标，还能预测新辅助疗法的治疗效果和判断预后。Ohuchida等[26]研究发现，在吉西他滨抵抗的PDAC的胰腺标本中，miR-142-5p、miR-204低表达，这两个miRNA高表达的患者存活时间比低表达的患者长，miR-142-5p 的表达可以作为预测患者对吉西他滨敏感性的指标。虽然目前化疗药物的耐药机制尚不清楚，有学者认为[27]是多因素、多因子作用的共同结果，但是随着miRNA的深入研究，通过对miRNA的再表达与抑制表达可能会成为减小胰腺癌耐药性的新方法。

4展望

miRNA的发现对于深入探讨生命现象的本质，解释细胞行为和疾病发生机制，具有重要的理论意义，到目前为止已有上百种miRNA被证明在疾病发展过程中异常表达，为许多肿瘤的治疗提供了新颖的治疗手段，比如乳腺癌、肾肿瘤和白血病等，但在胰腺癌中的治疗创新尚少。miRNA对靶基因信使RNA的特异性较低，一个突变不影响miRNA的抑制作用，作用于靶基因的同时，靶基因也会反作用于miRNA，所以在胰腺癌的进展中不可能只是单个的miRNA就能影响肿瘤的生长，可能是多个miRNA的共同作用才能对胰腺癌的抑制发挥显著作用，需要更进一步研究胰腺癌中多种miRNA与肿瘤间的相互作用，更加明确miRNA在胰腺癌中的作用机制。再者，目前的实验设计都是在动物模型、胰腺癌标本以及体外胰腺癌细胞株层面进行的，需要更多、更大样本的动物体内实验及基因功能实验。

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Advanced Research in MicroRNA in Pancreatic Adenocarcinoma Diagnosis and TreatmentYEQiu-wen,GANPing,TANJing. (DepartmentofAbdominalSurgery,YunnanProvinceTumorHospital/theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,China)

Abstract：Pancreatic cancer is a common and malignant gastrointestinal tumor,which is lack of effective treatment besides surgery,5 years survival rate is less than 5%.MicroRNAs are molecules influencing RNA-RNA interaction,performing a regulatory role in the metabolism,development,differentiation,proliferation and apoptosis of normal cells,as well as in carcinogenesis.More than 20 microRNAs have been identified,being involved in pancreatic adenocarcinoma biology,affecting tumor growth,metastatic potential,and chemotherapy sensitivity.

Key words：Pancreatic adenocarcinoma; MicroRNA; Diagnosis; Ttreatment

收稿日期：2014-08-25修回日期：2014-12-03编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.027

中图分类号：R446.1

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)14-2569-03